Πώς μπορούν να παραχθούν μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης από μια βακτηριακή αποικία που περιέχει το γονιδιακό ενδιαφέρον;

Η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων πρωτεΐνης από μια βακτηριακή αποικία που περιέχει το γονίδιο ενδιαφέροντος περιλαμβάνει αρκετά βασικά βήματα, το καθένα με τις δικές της αποχρώσεις. Εδώ είναι μια κατανομή:

1. Κλωνοποίηση του γονιδίου ενδιαφέροντος:

* Αποκτήστε το γονίδιο: Αυτό μπορεί να γίνει με διάφορες μεθόδους:

* ενίσχυση PCR: Χρησιμοποιώντας συγκεκριμένους εκκινητές για να αντιγράψετε το γονίδιο από ένα πρότυπο (π.χ. γονιδιωματικό DNA, cDNA).

* Περιοριστική πέψη και σύνδεση: Κοπή του διανυσματικού γονιδίου και στόχου με συγκεκριμένα ένζυμα και ενώνοντας μαζί τους.

* Σύνθεση του γονιδίου: Συνθέστε χημικά την αλληλουχία γονιδίων.

* Εισαγάγετε σε ένα διάνυσμα: Το γονίδιο εισάγεται σε ένα διάνυσμα (π.χ. πλασμίδιο) που μπορεί να αναπαραχθεί μέσα στα βακτήρια. Αυτό το διάνυσμα περιέχει συχνά στοιχεία όπως:

* Προέλευση της αναπαραγωγής: Επιτρέπει στον φορέα να αναπαραχθεί στα βακτήρια ξενιστή.

* Επιλέξτε δείκτης: Ένα γονίδιο που παρέχει αντίσταση σε ένα συγκεκριμένο αντιβιοτικό, επιτρέποντας την επιλογή βακτηρίων που φέρουν τον φορέα.

* Προαγωγός: Μια ακολουθία που ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων, εξασφαλίζοντας ότι μεταγράφεται το γονίδιο ενδιαφέροντος.

* Σημεία δέσμευσης ριβοσώματος: Μια ακολουθία που βοηθά τα ριβοσώματα να αναγνωρίσουν και να ξεκινήσουν τη μετάφραση.

2. Μετασχηματισμός και επιλογή:

* Μεταμορφώστε τα βακτήρια: Εισαγάγετε το διάνυσμα που περιέχει το γονίδιο στα βακτηριακά κύτταρα ξενιστή (π.χ., Ε. Coli). Αυτό μπορεί να γίνει μέσω μεθόδων όπως:

* Θερμικό σοκ: Εκθέτοντας τα βακτήρια σε σύντομους παλμούς θερμότητας για την αύξηση της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης.

* Ηλεκτροδιάκριση: Χρησιμοποιώντας ηλεκτρικούς παλμούς για τη δημιουργία προσωρινών πόρων στην κυτταρική μεμβράνη.

* Επιλογή: Επιλέξτε για βακτηριακές αποικίες που ανέλαβαν με επιτυχία τον φορέα χρησιμοποιώντας τον επιλέξιμο δείκτη. Αυτό συνήθως περιλαμβάνει την ανάπτυξη των βακτηρίων σε πλάκες άγαρ που περιέχουν το αντιβιοτικό που ο δείκτης παρέχει αντίσταση.

3. Έκφραση πρωτεΐνης:

* καλλιέργεια Τα βακτήρια: Αναπτύξτε τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα σε ένα κατάλληλο μέσο (π.χ. υγρό ζωμό) που παρέχει τα θρεπτικά συστατικά και τις συνθήκες που απαιτούνται για την παραγωγή πρωτεϊνών.

* επάγει την παραγωγή πρωτεΐνης: Ορισμένοι φορείς έχουν επαγώγιμους υποκινητές. Προσθέτοντας μια συγκεκριμένη χημική ουσία (π.χ. IPTG) στην καλλιέργεια, μπορείτε να ενεργοποιήσετε τη μεταγραφή και τη μετάφραση του γονιδίου ενδιαφέροντος, οδηγώντας στην παραγωγή πρωτεϊνών.

* Βελτιστοποιήστε τις συνθήκες έκφρασης: Οι συνθήκες ανάπτυξης της ταχύτητας (θερμοκρασία, pH, αερισμός) για τη μεγιστοποίηση της παραγωγής πρωτεϊνών.

4. Καθαρισμός πρωτεΐνης:

* Λύση κυττάρων: Ανοίξτε τα βακτήρια για να απελευθερώσετε την πρωτεΐνη. Αυτό μπορεί να γίνει μέσω διαφόρων μεθόδων όπως:

* Sonication: Χρησιμοποιώντας ηχητικά κύματα για να διαταράξετε τα κυτταρικά τοιχώματα.

* Γαλλικός Τύπος: Αναγκάζοντας τα κύτταρα μέσω ενός μικρού ανοίγματος σε υψηλή πίεση.

* Ενζυματική λύση: Χρησιμοποιώντας ένζυμα για να υποβαθμίσετε τα κυτταρικά τοιχώματα.

* Καθαρισμός: Απομονώστε την πρωτεΐνη -στόχο από το σύμπλοκο μίγμα κυτταρικών συστατικών. Διατίθενται διάφορες τεχνικές, συχνά συνδυάζοντας πολλαπλά βήματα:

* χρωματογραφία: Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση το μέγεθος, τη φόρτιση ή τη συγγένεια με συγκεκριμένους συνδέτες.

* φυγοκέντρηση: Διαχωρίζοντας τις πρωτεΐνες με βάση την πυκνότητα τους.

* βροχόπτωση: Χρησιμοποιώντας χημικές ουσίες για να κατακρημνίσετε τις πρωτεΐνες από το διάλυμα.

* Ανάλυση: Χαρακτηρίζετε την καθαρισμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας μεθόδους όπως:

* SDS-PAGE: Για την αξιολόγηση της καθαρότητας και του μοριακού βάρους.

* κηλίδωση Western: Για να επιβεβαιώσετε την ταυτότητα της πρωτεΐνης.

* Λειτουργικές δοκιμασίες: Για να επιβεβαιώσετε τη δραστηριότητα και τις επιθυμητές ιδιότητες της πρωτεΐνης.

5. Βελτιστοποίηση και κλίμακα:

* Βελτιστοποίηση: Επανατοποθετήστε ολόκληρη τη διαδικασία προσαρμόζοντας τις παραμέτρους όπως:

* Βακτηριακό στέλεχος: Επιλέξτε στελέχη γνωστά για αποτελεσματική έκφραση πρωτεΐνης.

* Design Vector: Βελτιστοποιήστε τον υποκινητή και άλλα ρυθμιστικά στοιχεία.

* συνθήκες καλλιέργειας: Ρυθμίστε τη θερμοκρασία, το ρΗ και τη σύνθεση θρεπτικών ουσιών για βέλτιστη απόδοση πρωτεΐνης.

* Scale-Up: Αυξήστε τον όγκο παραγωγής για να καλύψει τη ζήτηση για την πρωτεΐνη. Αυτό συχνά περιλαμβάνει τη χρήση μεγαλύτερων ζυμωτήρων και βιοαντιδραστήρων.

Βασικές εκτιμήσεις:

* Διαλυτότητα πρωτεΐνης: Ορισμένες πρωτεΐνες μπορούν να εκφραστούν σε αδιάλυτη μορφή (σώματα συμπερίληψης) μέσα στα βακτήρια. Αυτό απαιτεί ειδικές τεχνικές διαλυτοποίησης και αναδίπλωσης της πρωτεΐνης.

* τοξικότητα: Η πρωτεΐνη που παράγετε μπορεί να είναι τοξική για τον βακτηριακό ξενιστή, απαιτώντας συγκεκριμένες στρατηγικές για τη διαχείριση της παραγωγής της.

* μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις: Εάν η πρωτεΐνη απαιτεί συγκεκριμένες τροποποιήσεις (π.χ. γλυκοζυλίωση) που δεν υπάρχουν φυσικά σε βακτήρια, ενδέχεται να χρειαστούν εναλλακτικά συστήματα έκφρασης όπως κύτταρα θηλαστικών.

εναλλακτικές λύσεις για την βακτηριακή έκφραση:

Ενώ τα συστήματα βακτηριακής έκφρασης χρησιμοποιούνται ευρέως για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων πρωτεϊνών, υπάρχουν άλλες επιλογές:

* Συστήματα ζύμης: Περισσότερα ευκαρυωτικά από τα βακτήρια, προσφέροντας καλύτερες δυνατότητες αναδίπλωσης και γλυκοζυλίωσης.

* κυτταρικές σειρές θηλαστικών: Μπορεί να παρέχει ακριβέστερες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και υψηλότερες αποδόσεις σύνθετων πρωτεϊνών.

* κύτταρα εντόμων: Χρησιμοποιείται για την έκφραση σύνθετων πρωτεϊνών όπως τα αντισώματα.

Η επιλογή του συστήματος έκφρασης εξαρτάται από τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη και την επιδιωκόμενη χρήση του.