Πώς να σχεδιάσετε εκκινητές για την κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση

Η μεταλλαξογένεση κατευθυνόμενη από τον ιστότοπο (SDM) είναι μια in vitro μέθοδος δημιουργίας μιας μετάλλαξης σε μια γνωστή ακολουθία. Συχνά εκτελείται με μεθόδους που βασίζονται σε PCR. Τυπικά, μία ή δύο βάσεις αλλάζουν σε τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση. Οι εκκινητές μπορούν να σχεδιαστούν με τις επιθυμητές μεταλλάξεις για την εισαγωγή μικρών αλλαγών στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Η επέκταση εκκινητή και η αντίστροφη PCR μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή μεταλλάξεων μεγάλης κλίμακας. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να αλλάξει τη σύνθεση αμινοξέων μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Η τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση χρησιμοποιείται για τη μελέτη των αλλαγών της δραστηριότητας των πρωτεϊνών. Χρησιμοποιείται επίσης για τη δημιουργία πρωτεϊνών σύντηξης.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι η Κατευθυνόμενη Μεταλλαξιγένεση (SDM)
      – Ορισμός, Ρόλος, Μέθοδος
2. Πώς να σχεδιάσετε Primers για Μεταλλαξιγένεση Κατευθυνόμενη από Τοποθεσίες
     – Αντικαταστάσεις, Διαγραφές, Εισαγωγές

Βασικοί όροι:Διαγραφές, Εισαγωγές, Μεταλλάξεις, Μεταλλαξιγένεση Κατευθυνόμενη από Τοποθεσίες, Αντικαταστάσεις, Παραδοσιακή PCR

Τι είναι η Site-Directed Mutagenesis

Η κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση είναι μια τεχνική μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιείται για την εισαγωγή συγκεκριμένων αλλαγών σε μια νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός γονιδίου. Χρησιμοποιείται για την αλλαγή της αλληλουχίας αμινοξέων μιας πρωτεΐνης, την εισαγωγή ή την αφαίρεση θέσεων περιορισμού, την καταστροφή των θέσεων δέσμευσης μεταγραφής και τη δημιουργία πρωτεϊνών σύντηξης.

Διαδικασία

Κατά τη τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση, οι μεταλλάξεις εισάγονται στα πλασμίδια χρησιμοποιώντας εκκινητές, που αποτελούνται από την επιθυμητή μετάλλαξη. Ολόκληρο το πρότυπο ενισχύεται με PCR, ενσωματώνοντας τη μετάλλαξη στο πρότυπο. Στη συνέχεια, το μητρικό εκμαγείο αφαιρείται από το δείγμα με τη χρήση ενός ενζύμου, της εξαρτώμενης από μεθυλίωση ενδονουκλεάσης. Το προϊόν PCR ή το χαραγμένο μόριο πλασμιδίου με την επιθυμητή μετάλλαξη μετασχηματίζεται σε βακτήρια. Τα πλασμίδια μπορούν να απομονωθούν από τα βακτήρια με τις επιθυμητές τροποποιήσεις. Η διαδικασία της κατευθυνόμενης μεταλλαξιογένεσης φαίνεται στο σχήμα 1 .

Εικόνα 1:Μεταλλαξιγένεση Κατευθυνόμενη από Τοποθέτηση

Χρησιμοποιούνται τρεις κύριοι τύποι μεθόδων για την εισαγωγή επιθυμητών μεταλλάξεων στη μεταλλαξιογένεση κατευθυνόμενη από το σημείο. Είναι η παραδοσιακή PCR, η επέκταση εκκινητή και η αντίστροφη PCR. Η επέκταση εκκινητή και η αντίστροφη PCR μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή νουκλεοτιδικών αλλαγών μεγάλης κλίμακας.

Παραδοσιακή PCR

Η παραδοσιακή PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εισαγωγή ενός ή δύο νουκλεοτιδικών αλλαγών στην αλληλουχία στόχο με τροποποιημένους εκκινητές. Οι αλλαγές μπορεί να είναι αντικαταστάσεις, διαγραφές ή προσθήκες νουκλεοτιδίων. Η μετάλλαξη ενσωματώνεται στο αμπλικόνιο κατά τη διάρκεια της PCR. Ως εκ τούτου, η αρχική αλληλουχία αντικαθίσταται από τη μεταλλαγμένη αλληλουχία στον εκκινητή.

Επέκταση Primer

Στην επέκταση εκκινητή, η επιθυμητή μετάλλαξη ενσωματώνεται κατά τη διάρκεια μιας ένθετης PCR. Εδώ, η αλληλουχία στόχος πλαισιώνεται από δύο εκκινητές. Η επιθυμητή μετάλλαξη ενσωματώνεται στον εσωτερικό εκκινητή και, η μετάλλαξη εισάγεται στον δεύτερο γύρο PCR. Γενικά, η ειδικότητα μιας αντίδρασης PCR μειώνεται με τον αυξημένο αριθμό μη ταιριασμένων νουκλεοτιδίων στους εκκινητές. Ωστόσο, μακροί εσωτερικοί εκκινητές με μεταλλάξεις μεγάλης κλίμακας μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην επέκταση εκκινητών καθώς η ένθετη PCR μπορεί να αυξήσει την ειδικότητα της αντίδρασης PCR.

Αντίστροφη PCR

Η αντίστροφη PCR είναι μια μέθοδος ενίσχυσης άγνωστων θραυσμάτων DNA με το σχεδιασμό εκκινητών σε μια γνωστή αλληλουχία DNA. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την υποκατάσταση, τη διαγραφή ή την εισαγωγή νουκλεοτιδίων σε μεγάλη κλίμακα.

Οι εφαρμογές της κατευθυνόμενης μεταλλαξιογένεσης περιγράφονται παρακάτω.

1. Για τη μελέτη της δομής, της λειτουργίας και των καταλυτικών ιδιοτήτων των πρωτεϊνών
2. Για τη βελτίωση των ιδιοτήτων των πρωτεϊνών (μηχανική πρωτεϊνών)
3. Για να εισαγάγετε ή να αφαιρέσετε τοποθεσίες περιοριστικών ενδονουκλεασών.

Πώς να Σχεδιάζουμε Primers for Site-Directed Mutagenesis

Η μεταλλαξογένεση κατευθυνόμενη στον ιστότοπο είναι μια διαδικασία εισαγωγής της επιθυμητής μετάλλαξης μέσω ενός εκκινητή. Η μετάλλαξη μπορεί να είναι αντικατάσταση, εισαγωγή ή διαγραφή. Καθώς η ειδικότητα της PCR μειώνεται με τα αυξανόμενα αταίριαστα νουκλεοτίδια στον εκκινητή, η παραδοσιακή PCR μπορεί να εισάγει μόνο αλλαγές ενός ή δύο ζευγών βάσεων στην αλληλουχία στόχο. Άλλες μέθοδοι όπως η επέκταση εκκινητή και η αντίστροφη PCR μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή μεταλλάξεων μεγάλης κλίμακας. Ο σχεδιασμός εκκινητών στην κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση φαίνεται στο σχήμα 2 .

Εικόνα 2:Εκκινητές για Τοποκατευθυνόμενη Μεταλλαξιγένεση

Αντικατάσταση

Για αντικαταστάσεις, ένας από τους δύο εκκινητές θα πρέπει να περιέχει την επιθυμητή μετάλλαξη στη μέση του εκκινητή. Εδώ, ο ιστότοπος που περιέχει τη μετάλλαξη δεν προσκολλάται στην αλληλουχία στόχο, καθώς σχηματίζει παραμόρφωση.

Διαγραφή

Για τις διαγραφές, η ακολουθία που θα διαγραφεί από τον στόχο μπορεί να παραμεληθεί κατά τη σχεδίαση του εκκινητή. Καθώς αυτή η αλληλουχία βρίσκεται εκτός από την πλευρική περιοχή με εκκινητές, δεν θα ενισχύεται κατά τη διάρκεια της PCR.

Εισαγωγή

Για εισαγωγές, η ακολουθία που θα προστεθεί μπλέκεται στο 5' άκρο ενός εκ των εκκινητών κατά τη σχεδίαση του ασταριού. Επομένως, η ακολουθία που έχει εισαχθεί μπορεί επίσης να παραμείνει προσαρτημένη στο αμπλικόνιο.

Συμπέρασμα

Η μεταλλαξογένεση κατευθυνόμενη σε τοποθεσία είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την εισαγωγή μεταλλάξεων σε μια αλληλουχία DNA. Αυτές οι μεταλλάξεις μπορεί να είναι υποκαταστάσεις, εισαγωγές ή διαγραφές. Μικρής κλίμακας μεταλλάξεις μπορούν να εισαχθούν στην παραδοσιακή PCR. Μεταλλάξεις μεγάλης κλίμακας μπορούν να εισαχθούν σε επέκταση εκκινητή ή αντίστροφη PCR. Η εισαγωγή της μετάλλαξης γίνεται με ενσωμάτωση της επιθυμητής μετάλλαξης στον εκκινητή.

Αναφορά:

1. «Μέθοδοι για τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση». ΟΛΟΚΛΗΡΩΜΕΝΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ DNA , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "Site Directed Mutagenesis" By Knbusby – Ίδιο έργο (Public Domain) μέσω Commons Wikimedia