Γιατί είναι θερμοσταθερή η Taq Polymerase

Taq Η πολυμεράση είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιείται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για τη σύνθεση DNA in vitro . Είναι ανάλογο με το E. coli DNA πολυμεράση 1. Μπορεί να αντέξει τις υψηλές θερμοκρασίες που χρησιμοποιούνται στην PCR, διατηρώντας την ενζυματική του δράση. Taq Η πολυμεράση βρίσκεται φυσικά σε ένα θερμόφιλο βακτήριο γνωστό ως Thermus aquaticus . Το βακτήριο ζει σε εξαιρετικά θερμά περιβάλλοντα όπως υδροθερμικές οπές και θερμές πηγές. Ως εκ τούτου, είναι εξαιρετικά θερμοσταθερό. Η βέλτιστη θερμοκρασία για τη δραστηριότητα του Taq Η πολυμεράση είναι 75-80 °C.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι το Taq Polymerase
     – Ορισμός, Τοποθεσία, Ιδιότητες
2. Γιατί είναι θερμοσταθερή η Taq Polymerase
     – Θερμοφιλική φύση του Thermus Aquaticus
3. Ποιος είναι ο ρόλος της πολυμεράσης Taq στην PCR
     – Χρήση της πολυμεράσης Taq στην PCR

Βασικοί όροι:DNA Polymerase 1, PCR, Taq Polymerase, Thermophilic Bacteria,  Thermus aquaticus

Τι είναι το Taq Πολυμεράση

Taq Η πολυμεράση είναι μια εμπορικά διαθέσιμη, θερμοσταθερή DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται στην PCR για τη σύνθεση DNA. Προέρχεται από το ευβακτήριο που ονομάζεται Thermus aquaticus . Ο φυσικός βιότοπος του βακτηρίου είναι θερμές ιαματικές πηγές με θερμοκρασίες περιβάλλοντος 70-75 °C. Η δομή του Taq Η πολυμεράση φαίνεται στο σχήμα 1.

Εικόνα 1:Taq Polymerase

Taq Η πολυμεράση είναι μια 94 kD, εξαρτώμενη από το DNA πολυμεράση DNA, η οποία είναι ομόλογη με την DNA πολυμεράση 1 στο E. coli. Ως εκ τούτου, Taq Η πολυμεράση αποτελείται από θέση προσθήκης νουκλεοτιδίου 3' -ΟΗ, τη θέση δέσμευσης dNTP/DNA και τη θέση εξωνουκλεάσης 5' έως 3'. Ωστόσο, του λείπει η περιοχή εξωνουκλεάσης 3' έως 5' για τη διόρθωση των εισερχόμενων νουκλεοτιδίων.

Γιατί είναι το Taq Θερμοσταθερή πολυμεράση

Το βακτήριο όπου Taq Η πολυμεράση που εμφανίζεται φυσικά είναι θερμόφιλη. Ζει σε περιβάλλοντα με ακραίες θερμοκρασίες όπως υδροθερμικές οπές και θερμές πηγές. Thermus aquaticus είναι απομονωμένο από τις αφρώδεις ιαματικές πηγές του Εθνικού Πάρκου Yellowstone στις ΗΠΑ. Ως Thermus aquaticus είναι προσαρμοσμένο να ζει στις ακραίες θερμοκρασίες, το Taq Η πολυμεράση που απομονώνεται από το βακτήριο είναι επίσης ικανή να αντέχει σε υψηλότερες θερμοκρασίες . Οι θερμές πηγές του Εθνικού Πάρκου Yellowstone φαίνονται στην εικόνα 2 .

Εικόνα 2:Grand Prismatic Spring στο Εθνικό Πάρκο Yellowstone

Ποιος είναι ο ρόλος της Taq Polymerase στην PCR

Το θραύσμα Klenow της εξαρτώμενης από DNA πολυμεράσης DNA 1 χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά σε PCR που δεν είναι σταθερό στη θερμότητα. Ωστόσο, του έλειπε η δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 5' έως 3'. Η βέλτιστη θερμοκρασία του θραύσματος Klenow είναι 37 °C. Επομένως, ένα φρέσκο ​​ένζυμο έπρεπε να προστεθεί στην αντίδραση ανά κύκλο. Το υπόλοιπο θραύσμα Klenow μετουσιώθηκε κατά τη διάρκεια του σταδίου μετουσίωσης της PCR που λαμβάνει χώρα στους 95 °C. Επιπλέον, το θραύσμα Klenow μπορούσε να συνθέσει μόνο θραύσματα λιγότερα από 400 bp. Τα βήματα της PCR φαίνονται στο σχήμα 3 .

Εικόνα 3:PCR
1 – Μετουσίωσης στους 95 °C, 2 – ανόπτηση στους 68 °C, 3 – Επιμήκυνση στους 72 °C, 4 – Ολοκλήρωση ενός κύκλου

Εν τω μεταξύ, το 1966, ο Thomas D. Brock ανακάλυψε το θερμόφιλο, Thermus aquaticus από τις αφρώδεις ιαματικές πηγές του Εθνικού Πάρκου Yellowstone στις ΗΠΑ. Μετά από αυτό, το Taq πολυμεράση, η οποία εξάγεται από το Thermus aquaticus χρησιμοποιήθηκε στην PCR. Taq Η πολυμεράση χρησιμοποιείται για την επέκταση των εκκινητών με την προσθήκη νουκλεοτιδίων στο εκμαγείο κατά τη διάρκεια της PCR. Κατά τη διάρκεια της PCR, τα αντιδρώντα θερμαίνονται στους 95°C. Η φυσιολογική πολυμεράση DNA θα μετουσιωθεί από αυτή την υψηλή θερμοκρασία. Ωστόσο, η βέλτιστη θερμοκρασία για το Taq Η πολυμεράση είναι 75-80 °C. Επιπλέον, το ποσοστό σφάλματος του Taq Η πολυμεράση είναι περίπου ένα ανά εκατομμύριο ζεύγη βάσεων. Pfu είναι ένας άλλος τύπος θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA που χρησιμοποιείται αντί του Taq πολυμεράση σε PCR. Διαθέτει ικανότητα διόρθωσης. Επομένως, είναι πιο ακριβές από το Taq πολυμεράση.

Αναφορά:

1. «Taq και άλλες θερμοσταθερές πολυμεράσες DNA». SpringerLink , Springer, Dordrecht, 1 Ιανουαρίου 1970, Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. “Taq” By Adenosine – Own work (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. “Grand Prismatic Spring, Yellowstone National Park (3646969937)” Του Frank Kovalchek από τις ΗΠΑ – Grand Prismatic Spring, Yellowstone National Park (CC BY 2.0) μέσω Commons Wikimedia
3. "Pcr" του Magnus Manske (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia