Πώς να σχεδιάσετε Primers για QPCR

Η ποσοτική ή σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιείται ως δοκιμασία ρουτίνας για την παρακολούθηση των σχετικών αλλαγών στη γονιδιακή έκφραση κάτω από διαφορετικές πειραματικές συνθήκες. Ο σχεδιασμός εκκινητών καθώς και ανιχνευτών κατά τη διάρκεια της QPCR είναι ένας από τους πιο κρίσιμους παράγοντες που επηρεάζουν την ποιότητα και την επιτυχία της ανάλυσης. Ισχύουν διάφορες κατευθυντήριες γραμμές για το σχεδιασμό εκκινητών για QPCR:Η περιεκτικότητα σε GC των εκκινητών πρέπει να είναι 35-65%. Η θερμοκρασία τήξης των ασταριών πρέπει να είναι μεταξύ 60-68 °C. Θα πρέπει επίσης να αποφεύγονται οι δευτερεύουσες δομές, οι επαναλήψεις των Gs ή Cs που είναι μεγαλύτερες από 3 βάσεις και ο σχηματισμός διμερών εκκινητών.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι το QPCR
      – Ορισμός, Διεργασία, Χρήσεις
2. Πώς να σχεδιάσετε Primers για QPCR
     – Κατευθυντήριες γραμμές για το Primer Design για QPCR

Βασικοί όροι:Φθορίζουσες χρωστικές, Περιεκτικότητα GC, Θερμοκρασία Τήξης, Εκκινητές, Ποσοτική PCR (QPCR)

Τι είναι το QPCR

Το QPCR είναι ένας τύπος PCR που επιτρέπει την ποσοτικοποίηση του προϊόντος σε πραγματικό χρόνο. Οι φθορίζουσες βαφές μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον ποσοτικό προσδιορισμό των προϊόντων PCR με την επισήμανση τους σε κάθε βήμα. Δύο μέθοδοι σήμανσης με φθορισμό μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε προσδιορισμούς QPCR. Είναι η χρήση φθοριζόντων βαφών και των σημανθέντων με φθορισμό ανιχνευτών. Οι φθορίζουσες βαφές συνδέονται με το προϊόν PCR ενώ οι ανιχνευτές ανόπτονται με το προϊόν PCR για να σχηματίσουν ένα σταθερό τριπλό DNA. Η ευρέως χρησιμοποιούμενη φθορίζουσα βαφή στο QPCCR είναι SYBR Green ενώ οι ανιχνευτές μπορούν να είναι Taqman. Η χρήση ανιχνευτών στην ανίχνευση προϊόντων PCR κατά τη διάρκεια της QPCR δίνει πιο ακριβή αποτελέσματα και αυξάνει την ευαισθησία της ανάλυσης.

Εικόνα 1:Μηχανισμός QPCR

How to Design Primers for QPCR

Ο σχεδιασμός εκκινητών για QPCR είναι ζωτικής σημασίας για την αύξηση της αξιοπιστίας, της ακρίβειας καθώς και της ευαισθησίας της ανάλυσης. Κατευθυντήριες γραμμές για το σχεδιασμό των εκκινητών QPCR περιγράφονται παρακάτω.

1. Προϊόν PCR/Μέγεθος Amplicon – Το μέγεθος του προϊόντος PCR πρέπει να είναι 50-210 ζεύγη βάσεων σε μέγεθος.
2. Μήκος εκκινητών – Το μήκος των εκκινητών πρέπει να είναι 19-23 νουκλεοτίδια.
3. Περιεχόμενο GC – Το περιεχόμενο GC των εκκινητών πρέπει να είναι 35-65%.
4. Θερμοκρασία τήξης (Tm) – Η θερμοκρασία τήξης των ασταριών πρέπει να είναι 60-68 °C. Η θερμοκρασία ανόπτησης για την ανάλυση είναι 5 °C μικρότερη από την Tm των εκκινητών.
5. Σύνδεσμος εξωνίου-εξονίου – Κατά την ενίσχυση του cDNA με QPCR, οι εκκινητές θα πρέπει να εκτείνονται σε διασταύρωση εξονίου-εξονίου για να αποφευχθεί η ενίσχυση του μολυσμένου DNA.
6. Επανάληψη και εκτέλεση – Οι επαναλήψεις δινουκλεοτιδίων ( TCTCTCTCTC) και επαναλαμβανόμενα νουκλεοτίδια (π.χ. TAAAAAAAGC) θα πρέπει να αποφεύγονται.
7. 3' Συμπληρωματικότητα – Οι συμπληρωματικές περιοχές των 3' άκρων των μπροστινών και των αντίστροφων εκκινητών θα πρέπει να αποφεύγονται για να αποφευχθεί ο σχηματισμός διμερών εκκινητών.
8. Σταθερότητα 3' – Τα υπολείμματα G ή C πρέπει να περιλαμβάνονται στο 3' άκρο του ασταριού για να αυξηθεί η σταθερότητα της ανόπτησης.
9. Σφιγκτήρας GC – Ένας ή δύο σφιγκτήρες GC στο 5' άκρο του ασταριού αυξάνουν την ειδικότητα της ανόπτησης.
10. Ειδικότητα – Η ειδικότητα των εκκινητών θα πρέπει να ελεγχθεί από το BLAST
11. SNP – Οι εκκινητές δεν πρέπει να περιέχουν γνωστές παραλλαγές SNP (πολυμορφισμός ενός νουκλεοτιδίου)

Μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλά διαδικτυακά εργαλεία στο σχεδιασμό ασταριού στο QPCR, όπως Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank και  OAT.

Εικόνα 2:Σχηματισμός Primer-Dimers

Οι εκκινητές θα πρέπει να σχεδιάζονται με τέτοιο τρόπο ώστε να αποφεύγεται ο σχηματισμός εκκινητών-διμερών στο QPCR. Είναι κρίσιμο όταν χρησιμοποιούνται φθορίζουσες βαφές για την ανίχνευση του προϊόντος PCR, καθώς αυτές οι χρωστικές συνδέονται επίσης με τα διμερή εκκινητών για να δώσουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Συμπέρασμα

Το QPCR χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό προϊόντων PCR. Ο σχεδιασμός των εκκινητών είναι ζωτικής σημασίας στην QPCR για την αύξηση της ακρίβειας των αποτελεσμάτων. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να ακολουθείτε προσεκτικά τις κατευθυντήριες γραμμές για το σχεδιασμό εκκινητών για QPCR.

Αναφορά:

1. «Σχεδίαση και βελτιστοποίηση δοκιμασίας QPCR». LSR | Bio-Rad, Διαθέσιμο εδώ.