Διαφορά μεταξύ της εξαγωγής DNA και RNA

Η κύρια διαφορά μεταξύ της εξαγωγής DNA και RNA είναι ότι το επίπεδο pH της εκχύλισης DNA είναι pH 8 ενώ το επίπεδο pH της εκχύλισης RNA είναι pH 4,7. Το DNA τείνει να μετουσιώνεται και να μετακινείται στην οργανική φάση σε όξινο pH. Σε αλκαλικό pH, το RNA υφίσταται αλκαλική υδρόλυση λόγω της παρουσίας 2' ΟΗ στο σάκχαρο της ριβόζης.

Η εξαγωγή DNA και RNA είναι οι δύο διαδικασίες που εμπλέκονται στην απομόνωση και τον καθαρισμό των νουκλεϊκών οξέων από τα κύτταρα των ιστών. Και οι δύο διαδικασίες αποτελούνται από τρία βήματα. Η καλής ποιότητας DNA και RNA διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στα πειράματα μοριακής βιολογίας, βιοτεχνολογίας, γονιδιωματικής και επιδημιολογίας.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται 

1. Τι είναι η εξαγωγή DNA
     – Ορισμός, Διαδικασία
2. Τι είναι η εξαγωγή RNA
     – Ορισμός, Διαδικασία
3. Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ της εξαγωγής DNA και RNA
     – Περίγραμμα κοινών χαρακτηριστικών
4. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ της εξαγωγής DNA και RNA
     – Σύγκριση βασικών διαφορών

Βασικοί όροι:κυτταρική λύση, μετουσίωση πρωτεϊνών, Εξαγωγή DNA, pH, καθίζηση, εξαγωγή RNA

Τι είναι η εξαγωγή DNA

Η εξαγωγή DNA είναι η διαδικασία απομόνωσης και καθαρισμού του DNA. Το DNA μπορεί να απομονωθεί από αίμα, κατεψυγμένα δείγματα ιστού ή μπλοκ ιστού παραφίνης. Τα τρία στάδια της εκχύλισης του DNA είναι η κυτταρική λύση, η απομόνωση του DNA και η καθίζηση. Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής λύσης, οι φραγμοί της κυτταρικής μεμβράνης όπως η κυτταρική μεμβράνη και οι μεμβράνες του πυρήνα ανοίγουν για να εκτεθεί το DNA. Το επόμενο βήμα είναι η αφαίρεση των λιπιδίων της μεμβράνης από το δείγμα. Τέλος, η καθίζηση του DNA περιλαμβάνει την απομάκρυνση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το DNA από την πρωτεάση και την απομάκρυνση του RNA από τη RNase.

Εικόνα 1:Διαδικασία εξαγωγής DNA

Βασικά Πρωτόκολλα Εξαγωγής DNA

Παρακάτω παρουσιάζονται τα βασικά πρωτόκολλα εξαγωγής DNA.

1. Κυτταρική λύση με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων για λύση κυτταρικών μεμβρανών

2. Τα λιπίδια διασπώνται με απορρυπαντικά και επιφανειοδραστικά

3. Πέψη πρωτεϊνών με προσθήκη πρωτεάσης

4. Πέψη του RNA με προσθήκη RNase

5. Διαχωρισμός κυτταρικών υπολειμμάτων, χωνεμένων πρωτεϊνών, λιπιδίων και RNA με προσθήκη συμπυκνωμένου άλατος που ακολουθείται από φυγοκέντρηση

6. Καθίζηση με αιθανόλη του DNA με παγωμένη αιθανόλη ή ισοπροπανόλη. Η ιοντική ισχύς του οξικού νατρίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση της καθίζησης. Το κατακρημνισμένο DNA εμφανίζεται ως νήματα στο τελικό διάλυμα.

Εικόνα 2:Εξαγόμενο DNA

Η εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό του DNA από τις πρωτεΐνες. Εδώ, η φαινόλη μετουσιώνει τις πρωτεΐνες στο δείγμα και το DNA παραμένει στην υδατική φάση στο τέλος της εκχύλισης. Και, στην οργανική φάση, μπορείτε να βρείτε τις μετουσιωμένες πρωτεΐνες. Μια άλλη μέθοδος εξαγωγής DNA είναι ο καθαρισμός miniστήλης. Εδώ, η δέσμευση του DNA στη στήλη βασίζεται στο pH και τη συγκέντρωση άλατος του ρυθμιστικού διαλύματος.

Τι είναι η εξαγωγή RNA 

Η εξαγωγή RNA αναφέρεται στη διαδικασία καθαρισμού RNA από δείγματα. Η συμβατική μέθοδος εκχύλισης RNA ονομάζεται εκχύλιση θειοκυανικού γουανιδινίου-φαινόλης-χλωροφορμίου . Το θειοκυανικό γουανιδίνιο μετουσιώνει τις πρωτεΐνες. Επιπλέον, διαταράσσει τους δεσμούς υδρογόνου των μορίων του νερού και χρησιμεύει ως χαοτροπικός παράγοντας. Ένα ειδικό αντιδραστήριο χρησιμοποιείται στην εξαγωγή RNA που ονομάζεται Τρι-αντιδραστήριο . Περιέχει θειοκυανικό γουανιδίνιο, φαινόλη και οξικό νάτριο. Ο σκοπός των βασικών βημάτων της εκχύλισης RNA είναι παρόμοιος με αυτόν της εκχύλισης DNA. Το πρωτόκολλο για την εξαγωγή RNA περιγράφεται παρακάτω.

1. Τα κύτταρα πλένονται με παγωμένο PBS για να διατηρηθεί η ωσμωτικότητα των κυττάρων.

2. Αναρροφήστε τα κύτταρα και ομογενοποιήστε το δείγμα με Tri-reagent.

3. Προσθέστε χλωροφόρμιο και ανακινήστε.

4. Η φυγοκέντρηση μπορεί να οδηγήσει σε τρία στρώματα. Το ανώτερο στρώμα είναι το υδατικό στρώμα, το οποίο είναι διαυγές. Το μεσαίο στρώμα ή η ενδιάμεση φάση περιέχει το κατακρημνισμένο DNA. Το κάτω στρώμα είναι το οργανικό στρώμα, το οποίο είναι ροζ.

5. Αφαιρέστε το υδατικό στρώμα και προσθέστε ισοπροπανόλη. Η φυγοκέντρηση μπορεί να οδηγήσει σε σφαιρίδιο.

6. Πλύνετε το σφαιρίδιο με 75% αιθανόλη. Στεγνώστε το πέλλετ στον αέρα.

7. Διαλύστε το ίζημα με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ ή νερό.

Εικόνα 3:Εκχύλιση RNA από φαινόλη-χλωροφόρμιο

Η εξαγωγή RNA πραγματοποιείται γενικά σε pH κάτω από 7. Σε αλκαλικό pH, το RNA είναι πιο επιρρεπές να αποικοδομηθεί από αλκαλική υδρόλυση λόγω της παρουσίας μιας ομάδας ΟΗ στη θέση 2' της ζάχαρης ριβόζης. Επιπλέον, το RNA τείνει να παραμένει στην υδατική φάση σε όξινο pH. Από την άλλη πλευρά, το DNA τείνει να μετουσιώνεται και να μετακινείται στην οργανική φάση σε όξινο pH. Επομένως, η εκχύλιση DNA μπορεί να πραγματοποιηθεί σε περίπου pH 8. Το DNA αποτελείται από σάκχαρο δεοξυριβόζης και δεν υφίσταται αλκαλική υδρόλυση.

Similarities Between DNA and RNA Extraction 

• Η εξαγωγή DNA και RNA είναι οι διαδικασίες που εμπλέκονται στην απομόνωση και τον καθαρισμό νουκλεϊκών οξέων από βιολογικά δείγματα.
• Και οι δύο διαδικασίες περιλαμβάνουν λύση κυττάρων, καθαρισμό νουκλεϊκών οξέων από τα υπολείμματα και τις σχετικές πρωτεΐνες και προετοιμασία των εκχυλισμάτων.
• Και για τις δύο διαδικασίες, πρέπει να διατηρείτε συνθήκες κρύου καθ' όλη τη διάρκεια.
• Περιλαμβάνει φυγοκέντρηση στον διαχωρισμό των συστατικών του μείγματος.
• Πρέπει να απενεργοποιηθεί η δραστηριότητα των ενζύμων νουκλεάσης κατά τη διάρκεια και των δύο διαδικασιών.
• Η εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου είναι ένα από τα κρίσιμα βήματα και των δύο τύπων εκχυλίσεων.
• Το θειοκυανικό γουανιδίνιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την προστασία των νουκλεϊκών οξέων.
• Η καθίζηση του RNA μπορεί να γίνει με ισοπροπανόλη.
• Η ιοντική ισχύς του οξικού νατρίου χρησιμοποιείται για τη βελτίωση της καθίζησης των νουκλεϊκών οξέων.
• Τα δείγματα μπορούν να ποσοτικοποιηθούν μετρώντας το OD στα 260 nm.

Διαφορά μεταξύ της εξαγωγής DNA και RNA 

Ορισμός 

Εξαγωγή DNA: Διαδικασία απομόνωσης και καθαρισμού DNA

Εξαγωγή RNA:  Διαδικασία καθαρισμού RNA από δείγματα

Τύπος νουκλεϊκού οξέος που εκχυλίστηκε 

Εξαγωγή DNA: DNA 

Εξαγωγή RNA: RNA 

pH 

Εξαγωγή DNA: Έγινε στις 8 

Εξαγωγή RNA: Έγινε στις 4.7 

Βήματα 

Εξαγωγή DNA: Σπάσιμο των κυτταρικών μεμβρανών ή λύση των κυττάρων, αφαίρεση των λιπιδίων της μεμβράνης και καθίζηση του DNA 

Εξαγωγή RNA: Λύση κυττάρων, εκχύλιση θειοκυανικού γουανιδινίου-φαινόλης-χλωροφορμίου, παρασκευή με ισοπροπανόλη 

Χρήση επεξεργασμένου με DEPC νερού 

Εξαγωγή DNA: Κανένα 

Εξαγωγή RNA: Όλα τα αντιδραστήρια παρασκευάζονται με νερό επεξεργασμένο με DEPC

Αποθηκευτικός χώρος 

Εξαγωγή DNA: Το DNA μπορεί να εξαχθεί εκ των προτέρων και να αποθηκευτεί σε παρτίδες

Εξαγωγή RNA: Η εξαγωγή RNA γίνεται ακριβώς πριν από τις κατάντη διαδικασίες

Μακροπρόθεσμη αποθήκευση 

Εξαγωγή DNA: Στους -20 °C

Εξαγωγή RNA: Στους -80 °C 

Συμπέρασμα 

Η εξαγωγή DNA πραγματοποιείται σε pH 8. Το DNA τείνει να μετακινείται στην οργανική φάση καθώς μετουσιώνεται σε όξινο pH. Όμως, η εκχύλιση RNA πραγματοποιείται σε χαμηλό pH για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση από την αλκαλική υδρόλυση. Ο βασικός σκοπός των βημάτων τόσο της εκχύλισης του DNA όσο και του RNA είναι παρόμοιος. Η κύρια διαφορά μεταξύ της εξαγωγής DNA και RNA είναι οι συνθήκες pH που χρησιμοποιούνται σε κάθε τύπο εκχύλισης.

Αναφορά:

1. «Τα βασικά της εξαγωγής DNA». Alaska BioPREP Virtual Textbook, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, Διαθέσιμο εδώ
2. «Πρωτόκολλο απομόνωσης RNA και αντίστροφης μεταγραφής:Κύτταρα σε καλλιέργεια». abcam, Διαθέσιμο εδώ

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "Εικόνα 17 01 02" Από CNX OpenStax –  (CC BY 4.0) μέσω Commons Wikimedia  
2. «Εξαγωγή DNA» από τον Joo Nath – Δικό του έργο (CC BY-SA 4.0) μέσω του Commons Wikimedia  
3. "PhOH-CHCl3 extraction" By Squidonius (συζήτηση) – Δικό έργο (Αρχικό κείμενο:αυτοδημιούργητο) (Public Domain) μέσω Commons Wikimedia