Εξηγήστε πώς οι βιολόγοι βγάζουν το DNA από ένα κελί;
1. Κυτταρική λύση:
* Ανοίξτε τα κύτταρα: Αυτό είναι το πρώτο βήμα, όπου η κυτταρική μεμβράνη και η πυρηνική μεμβράνη διαταράσσονται για να απελευθερώσουν το DNA.
* Μηχανικές μέθοδοι: Αυτά περιλαμβάνουν τη χρήση ενός μπλέντερ (για μεγαλύτερα δείγματα), την υπερήχηση (χρησιμοποιώντας τα ηχητικά κύματα) ή την λείανση των κυττάρων (για τους ιστούς).
* Χημικές μέθοδοι: Χρησιμοποιώντας απορρυπαντικά (όπως SDS) ή ένζυμα (όπως λυσοζύμη) για να διασπαστούν οι κυτταρικές μεμβράνες.
2. Απομόνωση DNA:
* Διαχωρισμός DNA από άλλα κυτταρικά συστατικά: Μετά τη λύση, το μίγμα περιέχει DNA, πρωτεΐνες, λιπίδια και άλλα κυτταρικά συντρίμμια.
* Ενζυματική πέψη: Τα ένζυμα όπως η πρωτεϊνάση Κ χρησιμοποιούνται για τη διάσπαση των πρωτεϊνών, διαχωρίζοντας περαιτέρω το DNA από άλλα κυτταρικά συστατικά.
* βροχόπτωση άλατος: Η προσθήκη διαλυμάτων άλατος όπως το χλωριούχο νάτριο μπορεί να προκαλέσει το ϋΝΑ να καταβυθιστεί εκτός διαλύματος, ενώ άλλα κυτταρικά συστατικά παραμένουν διαλυμένα.
* Οργανική εξαγωγή: Χρησιμοποιώντας οργανικούς διαλύτες όπως η φαινόλη-χλωροφόρμιο για να χωρίσουν το DNA από πρωτεΐνες και άλλα κυτταρικά συστατικά. Το DNA παραμένει στην υδατική φάση, ενώ τα άλλα συστατικά εξάγονται στην οργανική φάση.
3. Καθαρισμός DNA:
* Αφαίρεση μολυσματικών ουσιών: Μετά την απομόνωση, το DNA μπορεί ακόμα να περιέχει ακαθαρσίες όπως RNA ή πρωτεΐνες.
* βροχόπτωση αιθανόλης: Η προσθήκη αιθανόλης στο διάλυμα αναγκάζει το DNA να βυθιστεί, επιτρέποντας περαιτέρω καθαρισμό.
* Χρωματογραφία στήλης: Χρησιμοποιώντας εξειδικευμένες στήλες με συγκεκριμένες ρητίνες που συνδέονται με το DNA, επιτρέποντας την επιλεκτική απομάκρυνση των μολυσματικών ουσιών.
4. Αποθήκευση DNA:
* Αποθήκευση του καθαρισμένου DNA: Το απομονωμένο DNA μπορεί να αποθηκευτεί σε ρυθμιστικά σε συγκεκριμένες θερμοκρασίες για μακροχρόνια χρήση.
Πρόσθετες εκτιμήσεις:
* Τύπος κυψέλης: Η μέθοδος που χρησιμοποιείται θα εξαρτηθεί από τον τύπο του κυττάρου που μελετάται, για παράδειγμα, τα βακτηριακά κύτταρα είναι ευκολότερο να λυθούν από τα κύτταρα των θηλαστικών.
* Ποσότητα DNA που απαιτείται: Η ποσότητα του απαιτούμενου DNA θα επηρεάσει την επιλεγμένη μέθοδο.
* Εφαρμογές κατάντη: Η προβλεπόμενη χρήση του DNA (π.χ. αλληλουχία, PCR, κλωνοποίηση) μπορεί να απαιτεί συγκεκριμένα βήματα καθαρισμού.
Παράδειγμα:
Μια κοινή μέθοδος για την εξαγωγή DNA από το αίμα περιλαμβάνει:
1. λύση: Το αίμα αναμιγνύεται με ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει απορρυπαντικά και ένζυμα για να ανοίξει τα κύτταρα και να απελευθερώσει το DNA.
2. Αφαίρεση πρωτεΐνης: Η πρωτεϊνάση Κ προστίθεται για να αφομοιώσει τις πρωτεΐνες και να διαχωρίζει περαιτέρω το DNA.
3. φυγοκέντρηση: Το μείγμα περιστρέφεται σε ένα φυγόκεντρο για να διαχωρίσει το DNA από άλλα κυτταρικά συστατικά.
4. Κατοικίες αιθανόλης: Η αιθανόλη προστίθεται για να κατακρημνίσει το DNA, το οποίο στη συνέχεια συλλέγεται με φυγοκέντρηση.
5. Πλύσιμο και αποθήκευση: Το σφαιρίδιο DNA πλένεται για να αφαιρέσει τυχόν μολυσματικές ουσίες και αποθηκεύεται σε διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος.
Αυτή η απλοποιημένη επισκόπηση υπογραμμίζει τα βασικά βήματα που εμπλέκονται στην εκχύλιση DNA. Υπάρχουν παραλλαγές και βελτιστοποιήσεις αυτών των μεθόδων ανάλογα με τις συγκεκριμένες πειραματικές απαιτήσεις.
