Ποια ένζυμα χρησιμοποιούν οι επιστήμονες για να δεσμεύσουν ένα νέο γονιδιακό πλασμίδιο DNA;
* Ένζυμα περιορισμού: Αυτά τα ένζυμα δρουν όπως το μοριακό ψαλίδι, το κοπτικό DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες. Είναι ζωτικής σημασίας για τη δημιουργία συμβατών άκρων στο πλασμίδιο και στο γονίδιο ενδιαφέροντος.
* Λιγάση: Αυτό το ένζυμο δρα σαν μοριακή κόλλα, ενώνει τα κομμένα άκρα του πλασμιδίου και του γονιδίου μαζί, σχηματίζοντας ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.
Ας σπάσουμε τη διαδικασία:
1. Digest: Το πλασμίδιο και το γονίδιο ενδιαφέροντος κόβονται με το ίδιο ένζυμο περιορισμού. Αυτό δημιουργεί συμβατά κολλώδη άκρα, τα οποία είναι σύντομες, μονόκλητες προεξοχές που μπορούν να βασίσουν το ζευγάρι μεταξύ τους.
2. Αποσύνδεση: Το κομμένο πλασμίδιο και το γονίδιο αναμιγνύονται μαζί με ένζυμο λιγάσης. Η λιγάση ενώνει τα κολλώδη άκρα, σχηματίζοντας ένα κυκλικό πλασμίδιο που περιέχει το νέο γονίδιο.
Άλλα σημαντικά ένζυμα:
* πολυμεράση DNA: Αυτό το ένζυμο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να γεμίσει κενά στο DNA, ειδικά εάν ο περιορισμός της πέψης δημιουργεί αμβλύ άκρα (χωρίς κολλώδη προεξοχές).
* Αλκαλική φωσφατάση: Αυτό το ένζυμο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόληψη της αυτο-επιλογής του πλασμιδίου, το οποίο μπορεί να συμβεί εάν το πλασμίδιο κόβεται με μόνο ένα ένζυμο περιορισμού.
Συνοπτικά: Ο συνδυασμός των ενζύμων περιορισμού και της λιγάσης είναι οι βασικοί παράγοντες στην εισαγωγή ενός νέου γονιδίου σε ένα πλασμίδιο. Άλλα ένζυμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ανάλογα με τις συγκεκριμένες λεπτομέρειες της διαδικασίας κλωνοποίησης.
