Πώς ο επιστήμονας απομονώνει το DNA για να το μελετήσει;
1. Κυτταρική λύση:
* Διαταραχή: Αυτό το βήμα περιλαμβάνει το σπάσιμο των κυττάρων για την απελευθέρωση του DNA. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με διάφορες μεθόδους, ανάλογα με τον τύπο κυττάρου:
* Φυσική διαταραχή: Μηχανικές μέθοδοι όπως η άλεση, η ανάμειξη ή η υπερήχηση μπορούν να χρησιμοποιηθούν για φυτικά ή ζωικά κύτταρα.
* Χημική λύση: Τα απορρυπαντικά και τα ένζυμα όπως η λυσοζύμη μπορούν να σπάσουν τις κυτταρικές μεμβράνες και τους τοίχους.
* Αφαίρεση κυτταρικών συντριμμιών: Το απελευθερωμένο DNA αναμειγνύεται με άλλα κυτταρικά συστατικά. Η φυγοκέντρηση χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό του DNA από τα συντρίμμια, αφήνοντας ένα υπερκείμενο DNA.
2. Κατοίκους DNA:
* Προσθήκη αλατιού: Οι υψηλές συγκεντρώσεις άλατος συμβάλλουν στην εξουδετέρωση των αρνητικών φορτίων στη ραχοκοκαλιά του DNA, επιτρέποντάς του να καταβυθιστεί εκτός διαλύματος.
* Προσθήκη αλκοόλ: Η αιθανόλη ή η ισοπροπανόλη προστίθενται στο διάλυμα, μειώνοντας τη διαλυτότητα του DNA και προκαλώντας την εξάλειψη του διαλύματος.
3. Απομόνωση DNA:
* φυγοκέντρηση: Το κατακρημνισμένο ϋΝΑ συλλέγεται με φυγοκέντρηση. Το DNA σχηματίζει ένα σφαιρίδιο στο κάτω μέρος του σωλήνα.
* Πλύσιμο: Το σφαιρίδιο πλένεται με ρυθμιστικό διάλυμα για να απομακρύνει τις ακαθαρσίες όπως τα άλατα και τις πρωτεΐνες.
4. Καθαρισμός DNA:
* Ενζυματική πέψη: Τα ένζυμα όπως η RNase μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απομάκρυνση της μόλυνσης RNA.
* Χρωματογραφία στήλης: Αυτή η τεχνική διαχωρίζει το DNA από άλλα μόρια με βάση το μέγεθος, τη φόρτιση ή τη συγγένεια δέσμευσης τους.
5. Ποσοτικοποίηση DNA:
* φασματοφωτομετρία: Η συγκέντρωση του DNA μετράται με την απορρόφησή του σε συγκεκριμένο μήκος κύματος (260 nm).
* Φθορομετρία: Οι φθορίζουσες βαφές συνδέονται με το DNA και εκπέμπουν φως, επιτρέποντας την ποσοτικοποίηση.
6. Αποθήκευση DNA:
* κατάψυξη: Το απομονωμένο DNA μπορεί να αποθηκευτεί στους -20 ° C ή -80 ° C για μακροχρόνια αποθήκευση.
Κοινές τεχνικές για απομόνωση DNA:
* Εκχύλιση φαινόλης-χλωροφόρμιο: Μια κλασική μέθοδος που χρησιμοποιεί οργανικούς διαλύτες για να διαχωρίσει το DNA από τις πρωτεΐνες.
* Σλάμα: Μια απλούστερη μέθοδος που χρησιμοποιεί αλάτι για να κατακρημνίσει το DNA.
* Στήλες περιστροφής: Βολικά κιτ που χρησιμοποιούν μεμβράνη για να δεσμεύσουν το DNA και να αφαιρέσουν τις ακαθαρσίες.
* Απομόνωση βασισμένη σε μαγνητικά σφαιρίδια: Χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα με παράγοντες δέσμευσης DNA για την απομόνωση του DNA.
Αυτές οι τεχνικές επιτρέπουν στους επιστήμονες να αποκτήσουν καθαρό DNA από διάφορες πηγές, επιτρέποντάς τους να εκτελούν ένα ευρύ φάσμα μελετών μοριακής βιολογίας, συμπεριλαμβανομένης της κλωνοποίησης γονιδίων, της αλληλουχίας DNA και των γενετικών εξετάσεων.
