Πώς παρασκευάζεται το DNA βακτηρίων για χρήση στη μεταφορά γονιδίων;
1. Απομόνωση του βακτηριακού DNA
* Βήμα 1:Λύση κυττάρων: Τα βακτηριακά κύτταρα είναι σπασμένα ανοιχτά για να απελευθερώσουν το περιεχόμενό τους, συμπεριλαμβανομένου του DNA. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί από:
* Μηχανικές μέθοδοι:
* Γαλλικός Τύπος: Αυτή η συσκευή αναγκάζει τα κύτταρα μέσω ενός στενού ανοίγματος, δημιουργώντας υψηλή πίεση και εκρήγνυντας τα ανοιχτά.
* Sonication: Τα ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας χρησιμοποιούνται για τη δόνηση των κυττάρων, προκαλώντας τους να σπάσουν.
* Φρεμάπιση χάντρας: Τα κύτταρα υποβάλλονται σε διέγερση υψηλής ταχύτητας με μικροσκοπικά σφαιρίδια, τα οποία διαταράσσουν φυσικά τα κυτταρικά τοιχώματα.
* Χημικές μέθοδοι:
* ένζυμα: Η λυσοζύμη (για θετικά με Gram βακτηρίδια) ή τα ένζυμα που διασπούν πεπτιδογλυκάνη (το κυτταρικό τοίχωμα) χρησιμοποιούνται για την αφομοίωση του κυτταρικού τοιχώματος.
* απορρυπαντικά: Αυτοί οι παράγοντες διαταράσσουν την κυτταρική μεμβράνη, απελευθερώνοντας κυτταρικά περιεχόμενα.
* Βήμα 2:Αφαίρεση κυτταρικών συντριμμιών: Μετά τη λύση, το κυτταρικό λύση (μείγμα περιεχομένων κυττάρων) πρέπει να καθαριστεί. Αυτό συνήθως περιλαμβάνει φυγοκέντρηση για τον διαχωρισμό του DNA από τα κυτταρικά υπολείμματα, τις πρωτεΐνες και άλλα μόρια.
* Βήμα 3:Καθαρισμός DNA: Το υπόλοιπο DNA καθαρίζεται περαιτέρω χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους:
* Εκχύλιση φαινόλης-χλωροφόρμιο: Αυτή η κλασική τεχνική διαχωρίζει το DNA από πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας ένα μίγμα φαινόλης και χλωροφόρμιο. Το DNA θα παραμείνει στην υδατική φάση, ενώ οι πρωτεΐνες θα εξάγονται στην οργανική φάση.
* Χρωματογραφία στήλης: Μια ποικιλία από εμπορικά διαθέσιμα κιτ χρησιμοποιούν στήλες με ρητίνες που δεσμεύουν επιλεκτικά το DNA, επιτρέποντας τον καθαρισμό.
* βροχόπτωση: Το DNA κατακρημνίζεται από διάλυμα χρησιμοποιώντας αιθανόλη ή ισοπροπανόλη, με αποτέλεσμα ένα συμπυκνωμένο σφαιρίδιο.
2. Χειραγώγηση του βακτηριακού DNA
* Ένζυμα περιορισμού: Αυτά τα ένζυμα χρησιμοποιούνται για την κοπή του DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες, δημιουργώντας θραύσματα κατάλληλα για κλωνοποίηση γονιδίων.
* Λιγάσες: Τα ένζυμα που ενώνουν τα θραύσματα DNA μαζί. Είναι απαραίτητα για την εισαγωγή γονιδίων σε φορείς.
* Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR): Αυτή η τεχνική επιτρέπει την ενίσχυση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA. Χρησιμοποιείται για τη δημιουργία πολλαπλών αντιγράφων γονιδίων για κλωνοποίηση ή για την απομόνωση ειδικών θραυσμάτων DNA από ένα μεγαλύτερο γονιδίωμα.
3. Προετοιμασία διανυσμάτων κλωνοποίησης
* φορείς: Αυτά είναι μόρια DNA (συχνά πλασμίδια ή βακτηριοφάγους) που χρησιμεύουν ως οχήματα για τη μεταφορά ξένων DNA σε βακτηριακά κύτταρα.
* Τροποποίηση φορέα:
* Περιορισμός ενζύμου πέψη: Οι φορείς κόβονται με ένζυμα περιορισμού για να δημιουργήσουν ανοιχτά "κολλώδη άκρα" όπου μπορεί να εισαχθεί το ξένο DNA.
* σύνδεση: Το εξωτερικό θραύσμα ϋΝΑ συνδέεται (ενώνει) στον φορέα χρησιμοποιώντας λιγάση ϋΝΑ.
4. Μετασχηματισμός (μεταφορά γονιδίων σε βακτήρια)
* αρμόδια κύτταρα: Τα βακτηρίδια αντιμετωπίζονται για να τους κάνουν πιο δεκτικοί στην ανάληψη ξένου DNA. Αυτό μπορεί να γίνει με διάφορες μεθόδους:
* Χημική θεραπεία: Διαλύματα όπως το χλωριούχο ασβέστιο (CaCL2) ή το χλωριούχο μαγνήσιο (MGCL2) χρησιμοποιούνται για να καταστούν τα βακτηριακά κυτταρικά τοιχώματα πιο διαπερατά.
* Ηλεκτροδιάκριση: Ένας σύντομος ηλεκτρικός παλμός δημιουργεί προσωρινούς πόρους στις μεμβράνες βακτηριακών κυττάρων, επιτρέποντας την είσοδο του DNA.
* Μετασχηματισμός: Τα αρμόδια κύτταρα εκτίθενται στον ανασυνδυασμένο φορέα, επιτρέποντας στον φορέα να εισέλθει στα βακτηριακά κύτταρα.
* Επιλογή: Οι φορείς συνήθως μεταφέρουν γονίδια αντοχής στα αντιβιοτικά. Αυτό επιτρέπει στους επιστήμονες να επιλέξουν για βακτηριακά κύτταρα που έχουν πάρει με επιτυχία τον φορέα.
Βασικά σημεία
* Ασφάλεια: Οι αποστειρωμένες τεχνικές είναι κρίσιμες στο παρασκεύασμα DNA για την πρόληψη της μόλυνσης.
* Έλεγχος ποιότητας: Η ποιότητα του απομονωμένου DNA είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχή μεταφορά γονιδίων.
* Εφαρμογές: Αυτές οι τεχνικές είναι ζωτικής σημασίας για διάφορες εφαρμογές γενετικής μηχανικής, συμπεριλαμβανομένης της κλωνοποίησης γονιδίων, της παραγωγής πρωτεϊνών και της δημιουργίας γενετικά τροποποιημένων οργανισμών.
Επιτρέψτε μου να ξέρω αν θέλετε περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με οποιαδήποτε συγκεκριμένη πτυχή της παρασκευής βακτηριακού DNA ή της γονιδιακής μεταφοράς!
