Ποιος είναι ο ένας τρόπος για να προσδιοριστεί εάν μια βακτηριακή καλλιέργεια έχει λάβει ανασυνδυασμένο πλασμίδιο;
Δείτε πώς λειτουργεί αυτό:
1. Επιλογή γονιδίου δείκτη: Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια συχνά φέρουν ένα γονίδιο που προσδίδει αντίσταση σε ένα συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Για παράδειγμα, το γονίδιο για την αντίσταση στην αμπικιλλίνη (AMPR).
2. Μετασχηματισμός: Τα βακτήρια μετασχηματίζονται με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.
3. Επιλογή: Τα μετασχηματισμένα βακτήρια αναπτύσσονται σε ένα μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό στο οποίο το γονίδιο επιλογής δεικτών παρέχει αντίσταση (π.χ. αμπικιλλίνη).
4. Ανάπτυξη: Μόνο βακτήρια που έχουν πάρει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με το γονίδιο AMPR θα επιβιώσουν και θα αναπτυχθούν στο μέσο που περιέχει αντιβιοτικά. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι μπορούν να απενεργοποιήσουν το αντιβιοτικό.
5. Επιβεβαίωση: Για να διασφαλιστεί ότι τα βακτηρίδια έχουν πράγματι αναλάβει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν πρόσθετες μέθοδοι επιβεβαίωσης όπως PCR ή Colony Hybridization για την επαλήθευση της παρουσίας της συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA εντός του πλασμιδίου.
Παράδειγμα:
* Ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και το γονίδιο AMPR χρησιμοποιείται για τη μετατροπή των βακτηρίων.
* Τα βακτήρια είναι επιμεταλλωμένα σε άγαρ που περιέχουν αμπικιλλίνη.
* Μόνο τα βακτήρια που περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (με γονίδια GFP και AMPR) θα αναπτυχθούν.
* Αυτές οι αποικίες μπορούν στη συνέχεια να εξεταστούν περαιτέρω για έκφραση GFP χρησιμοποιώντας ένα φθορίζοντα μικροσκόπιο.
Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την επιλογή βακτηρίων που έχουν λάβει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και παρέχει έναν απλό τρόπο για τον εντοπισμό επιτυχημένων μετασχηματισμών.
