Οι τεχνικές ποσοτικοποίησης μπορούν να διακρίνουν τα ζωντανά κύτταρα από νεκρά σε μια κουλτούρα;
1. Αναλύσεις αποκλεισμού βαφής:
* Trypan μπλε αποκλεισμός: Αυτή είναι μια κλασική μέθοδος. Τα ζωντανά κύτταρα έχουν άθικτες κυτταρικές μεμβράνες που εμποδίζουν την είσοδο της βαφής, ενώ τα νεκρά κύτταρα έχουν συμβιβαστεί μεμβράνες επιτρέποντας στη βαφή να εισέλθει και να λεκιάσει το κυτταρόπλασμα μπλε.
* Αποκλεισμός ιωδιούχου προπιδίου (PI): Παρόμοια με το Trypan Blue, το PI είναι μια φθορίζουσα βαφή που εισέρχεται σε νεκρά κύτταρα αλλά όχι ζωντανά κύτταρα.
2. Δοκιμασίες μεταβολικής δραστηριότητας:
* Δοκιμασία MTT: Αυτή η χρωματομετρική δοκιμασία μετρά τη δραστηριότητα των μιτοχονδριακών ενζύμων σε ζωντανά κύτταρα. Τα ζωντανά κύτταρα μειώνουν το MTT (ένα κίτρινο αλάτι τετραζολίου) στο Formazan, το οποίο είναι ένα μοβ formazan προϊόν που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί.
* Δοκιμασία μείωσης Resazurin: Αυτή η δοκιμασία που βασίζεται σε φθορισμό μετρά τη μείωση της ρεσαζουρίνης (μη φθορίζουσας) σε ρεσουφίνη (εξαιρετικά φθορίζουσα) από ζωντανά κύτταρα.
* Δοκιμασία ATP: Αυτή η δοκιμασία μετρά τα επίπεδα τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP), ένα βασικό ενεργειακό μόριο που βρίσκεται στα ζωντανά κύτταρα.
3. Κοσκίδα DNA:
* Hoechst 33342: Αυτή η βαφή συνδέεται με το DNA και χρησιμοποιείται για να λεκιάσει τόσο τα ζωντανά όσο και τα νεκρά κύτταρα. Ωστόσο, τα ζωντανά κύτταρα παρουσιάζουν πιο ξεχωριστό μπλε φθορισμό σε σύγκριση με τα νεκρά κύτταρα.
* dapi: Παρόμοια με το Hoechst, το DAPI είναι μια φθορίζουσα βαφή που κηλιδώνει το DNA. Τα ζωντανά κύτταρα εμφανίζουν φωτεινότερο και πιο έντονο μπλε φθορισμό σε σύγκριση με τα νεκρά κύτταρα.
4. Ανάλυση κυτταρικού κύκλου:
* Κυομετρία ροής: Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί λέιζερ και φθορίζουσες βαφές για να αναλύσει την περιεκτικότητα σε DNA των κυττάρων, επιτρέποντας τη διάκριση μεταξύ κυττάρων σε διαφορετικά στάδια του κυτταρικού κύκλου. Τα νεκρά κύτταρα συχνά εμφανίζουν κατακερματισμένο DNA και μπορούν να ταυτοποιηθούν μέσω συγκεκριμένων μοτίβων χρώσης.
5. Άλλες τεχνικές:
* Calcein AM/Ethidium Homodimer-1 (ETHD-1) Διεύθυνση: Αυτή η δοκιμασία συνδυάζει δύο φθορίζουσες βαφές. Το Calcein AM, ένα μη φθορίζοντα μόριο, μετατρέπεται σε πράσινη φθορίζουσα βαφή από ενεργές εστεράσες σε ζωντανά κύτταρα. Το Ethd-1, μια κόκκινη φθορίζουσα βαφή, εισέρχεται μόνο στα νεκρά κύτταρα με συμβιβασμένες μεμβράνες.
* Καταμέτρηση κυττάρων με αυτοματοποιημένα συστήματα: Μερικοί αυτοματοποιημένοι μετρητές κυττάρων χρησιμοποιούν αλγόριθμους απεικόνισης και ανάλυσης για τη διαφοροποίηση των ζωντανών και νεκρών κυττάρων με βάση τη μορφολογία και τα εσωτερικά χαρακτηριστικά.
Σημαντικές εκτιμήσεις:
* Ακρίβεια: Η επιλογή της μεθόδου εξαρτάται από τον τύπο κυττάρου, τους στόχους του πειράματος και τους διαθέσιμους πόρους. Είναι σημαντικό να επιλέξετε μια μέθοδο που είναι ακριβής και αξιόπιστη για τη συγκεκριμένη εφαρμογή.
* Ειδικότητα: Ορισμένες τεχνικές είναι πιο συγκεκριμένες για ορισμένους τύπους κυτταρικού θανάτου (π.χ. απόπτωση ή νέκρωση).
Χρησιμοποιώντας τις κατάλληλες τεχνικές ποσοτικοποίησης, οι ερευνητές μπορούν να αξιολογήσουν με ακρίβεια τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε μια καλλιέργεια, η οποία είναι απαραίτητη για την κατανόηση των κυτταρικών διεργασιών, της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων και των επιδράσεων διαφόρων πειραματικών συνθηκών.
