Πώς να υπολογίσετε τη συγκέντρωση RNA
Υπολογίστε ποσοτικά το δείγμα RNA σας μετρώντας την απορρόφηση του υπεριώδους φωτός (UV). Ένα φασματοφωτόμετρο νανο-σταγόνων θα χρησιμοποιήσει μόνο ένα ή δύο μικρολίτρα του δείγματός σας, τα οποία μπορείτε να ανακτήσετε. Άλλα φασματοφωτόμετρα απαιτούν πολύ μεγαλύτερο δείγμα. Ο συντελεστής εξαφάνισης για νουκλεοτίδια σε μήκος κύματος UV 260 nm σε φωτεινή διαδρομή 1 cm είναι 20. Με βάση αυτόν τον συντελεστή εξάλειψης, η απορρόφηση 40 μg/ml RNA υπό τις ίδιες συνθήκες είναι μία. Χρησιμοποιώντας αυτές τις πληροφορίες, μπορείτε να υπολογίσετε τη συγκέντρωση του δείγματος RNA σας.
- Φασματοφωτόμετρο
- Αριθμομηχανή
-
Μην ξεχάσετε να βαθμονομήσετε το Φασματοφωτόμετρο σας. Η εκτέλεση μιας γρήγορης ηλεκτροφορητικής γέλης θα επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα των προδιαγραφών σας.
-
Μην υποθέσετε ότι το δείγμα σας είναι καθαρό. Αφιερώνοντας χρόνο για μια αναλογία OD260/OD280 εξοικονομείτε χρόνο και χρήμα στο δρόμο.
Κάντε μια αραίωση, εάν χρειάζεται, του δείγματός σας. Μια τυπική αραίωση για μια μικροκυβέτα είναι 1:40. Κάντε αυτήν την αραίωση προσθέτοντας 2µL δείγματος RNA σε 78μL αποστειρωμένου νερού.
Ακολουθήστε τα πρωτόκολλα του συγκεκριμένου φασματοφωτόμετρου για να βαθμονομήσετε το μηχάνημα χρησιμοποιώντας ένα κενό και, στη συνέχεια, προσδιορίστε την οπτική πυκνότητα του δείγματός σας σε μήκος κύματος UV 260 nm.
Πολλαπλασιάστε την απορρόφηση του δείγματός σας με τον συντελεστή αραίωσής σας επί 40μg RNA/mL. Η εξίσωση θα ήταν:"Συγκέντρωση RNA (μg/ml) =(OD260) x (συντελεστής αραίωσης) x (40 μg RNA/ml)/(1 μονάδα OD260)" (Hofstra.edu) Για παράδειγμα:Εάν αραιώσατε το δείγμα σας με 1:40 και η ένδειξη απορρόφησής σας ήταν 0,08, θα πολλαπλασιάζατε 0,08 x 40 x 40 =128 μg/ml =0,13 μg/μL
Υπολογίστε την καθαρότητα του δείγματός σας λαμβάνοντας μια άλλη ένδειξη απορρόφησης σε μήκος κύματος UV 280 nm. Η αναλογία OD 260/OD 280 θα υποδείξει εάν -- και σε ποιο επίπεδο -- το δείγμα σας είναι μολυσμένο με πρωτεΐνη ή φαινόλη. Ένα αποτέλεσμα 1,8 έως 2,0 υποδεικνύει ποιοτικό RNA.
