Πώς υπολογίζετε τη θερμοκρασία τήξης του ολιγονουκλεοτιδίου;
1. Βασικός τύπος (κανόνας Wallace):
Αυτή η απλοποιημένη φόρμουλα είναι ένα καλό σημείο εκκίνησης για μικρά ολιγονουκλεοτίδια (14-20 βάσεις):
tm =4 ° C (g + c) + 2 ° C (a + t)
* g + c: Αριθμός βάσεων γουανίνης και κυτοσίνης
* a + t: Αριθμός βάσεων αδενίνης και θυμίνης
2. Πιο ακριβείς μέθοδοι:
Για μεγαλύτερη ακρίβεια, ειδικά για μεγαλύτερες ακολουθίες, εξετάστε αυτές τις μεθόδους:
* Μέθοδος πλησιέστερου γείτονα: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί προ-υπολογισμένες θερμοδυναμικές παραμέτρους για κάθε πιθανό συνδυασμό δινουκλεοτιδίου εντός του ολιγονουκλεοτιδίου. Θεωρεί τις αλληλεπιδράσεις βασικής στοίβαξης και είναι πιο εξελιγμένη από τη βασική φόρμουλα. Τα ηλεκτρονικά εργαλεία και το λογισμικό όπως το OligocalC ή το Oligoanalyzer του IDT είναι άμεσα διαθέσιμα για αυτόν τον υπολογισμό.
* Θερμοδυναμικοί αλγόριθμοι: Αυτοί οι αλγόριθμοι, όπως αυτοί που χρησιμοποιούνται σε προγράμματα όπως το Primer3 ή το Oligoanalyzer, χρησιμοποιούν πιο σύνθετα θερμοδυναμικά μοντέλα για να υπολογίζουν διάφορους παράγοντες όπως η συγκέντρωση άλατος, το ρΗ και η συγκέντρωση ολιγονουκλεοτιδίων.
Παράγοντες που επηρεάζουν το TM:
* Σύνθεση βάσης: Τα ομόλογα G-C είναι ισχυρότεροι από τους ομολόγους Α-T, οδηγώντας σε υψηλότερες τιμές TM για αλληλουχίες με υψηλότερη περιεκτικότητα σε G-C.
* Μήκος: Τα μεγαλύτερα ολιγονουκλεοτίδια έχουν γενικά υψηλότερες τιμές TM λόγω περισσότερων ζευγών βάσεων.
* συγκέντρωση άλατος: Η αύξηση της συγκέντρωσης άλατος (π.χ., NaCl) σταθεροποιεί το διπλό DNA, με αποτέλεσμα υψηλότερο TM.
* ph: Οι ακραίες τιμές του ρΗ μπορούν να αποσταθεροποιήσουν το DNA Duplex και να μειώσουν το TM.
* αναντιστοιχίες: Οι αναντιστοιχίες εντός της αλληλουχίας ολιγονουκλεοτιδίων μειώνουν το TM.
* τροποποιήσεις DNA: Οι τροποποιήσεις όπως η μεθυλίωση μπορούν επίσης να επηρεάσουν το TM.
Λογισμικό και ηλεκτρονικά εργαλεία:
Αρκετά ηλεκτρονικά εργαλεία και πακέτα λογισμικού είναι διαθέσιμα για τον υπολογισμό του TM:
* oligocalc: [https://www.oligo.net/calc/j(https://www.oligo.net/calc/)
* IDT Oligoanalyzer: [https://www.idtdna.com/calc/analyzer ](https://www.idtdna.com/calc/analyzer)
* Primer3: [https://primer3.ut.eee/j(https://primer3.ut.ee/)
* ThermoFisher Scientific TM Υπολογιστής: [https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/dna-cloning/tools-and-riesources/tm-calculator.html] (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/dna-cloning/tools-and-resources/tm-calculator.html)
Θυμηθείτε:
* Το TM είναι μια θεωρητική αξία που μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες. Η πειραματική επικύρωση είναι συχνά απαραίτητη.
* Επιλέξτε μια κατάλληλη μέθοδο και εργαλείο που βασίζεται στη συγκεκριμένη εφαρμογή και το μήκος ολιγονουκλεοτιδίου.
Με την κατανόηση των παραγόντων που επηρεάζουν το TM και χρησιμοποιώντας τις κατάλληλες μεθόδους υπολογισμού, μπορείτε να προβλέψετε με ακρίβεια τη θερμοκρασία τήξης του ολιγονουκλεοτιδίου σας και να βελτιστοποιήσετε τα πειράματά σας.
