Ο Χημικός και Βιολογικός Χαρακτηρισμός Εντοπίζει την Πίστη των Νανοσωματιδίων
Το γραφένιο έχει μεταμορφώσει την έρευνα υλικού παγκοσμίως. Το γραφένιο θεωρείται ένα καινοτόμο υλικό που θα μπορούσε να επηρεάσει μια μεγάλη ποικιλία πεδίων. Οι ηλεκτρονικές, χημικές και δομικές πτυχές του γραφενίου είναι υπεύθυνες για τις ευρέως διαδεδομένες δυνατότητες εφαρμογής του. Το γραφένιο, ένα αλλότροπο του άνθρακα που τραβάει την προσοχή, ανήκει στη δισδιάστατη (2D) κατηγορία υλικών.
Η αναγνώριση του πεδίου εφαρμογής του γραφενίου έχει πράγματι διαδώσει τα δισδιάστατα υλικά και έχει παρακινήσει τους ερευνητές να βρουν νέες πολυεπίπεδες δομές. Το γραφένιο έχει ένα περίεργο πλαίσιο κηρήθρας που σχηματίζεται με sp υβριδισμένα άτομα άνθρακα [1]. Η ηλεκτρική του αγωγιμότητα και η θερμική του αντίσταση καθιστούν το γραφένιο εξαιρετική επιλογή για ηλεκτρονικές συσκευές, εφαρμογές αποθήκευσης κ.λπ. Η δυνατότητα σύζευξης π στο γραφένιο καθιστά δυνατή τη φόρτωση αρωματικών φαρμάκων για τη χορήγηση φαρμάκων. Συγκεκριμένα, το γραφένιο έχει διερευνηθεί στη φωτοθερμική θεραπεία [2].
Μαζί με το γραφένιο, άλλα υλικά που σχετίζονται με το γραφένιο όπως το οξείδιο του γραφενίου (GO) και το ανηγμένο οξείδιο του γραφενίου (rGO) κερδίζουν επίσης ενδιαφέρον. Το οξείδιο του γραφενίου είναι η οξειδωμένη μορφή του γραφενίου. Η μείωση του GO από διαφορετικούς αναγωγικούς παράγοντες αποδίδει το rGO με ιδιότητες συγκρίσιμες με το παρθένο γραφένιο. Το rGO παρουσιάζει ελαττώματα σε σύγκριση με το γραφένιο που λαμβάνεται από γραφίτη. Αλλά το rGO καθιστά δυνατή την απόκτηση γραφενίου χύμα με χαμηλό κόστος. Ως εκ τούτου, το rGO έχει διερευνηθεί εκτενώς για διάφορες εφαρμογές. Διαφορετικοί αναγωγικοί παράγοντες, όπως ένυδρη υδραζίνη, ασκορβικό οξύ, NaBH4 , κ.λπ., χρησιμοποιούνται για μείωση GO (3). Η χρήση τοξικών αναγωγικών παραγόντων όπως η ένυδρη υδραζίνη είναι μειονεκτική, καθώς είναι εκρηκτική και δύσκολη στη χρήση.
Από την άλλη πλευρά, το ασκορβικό οξύ παρέχει ένα ήπιο αναγωγικό περιβάλλον που μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά το GO σε rGO. Το rGO που παράγεται από την αναγωγή του GO με ασκορβικό οξύ εμφάνισε ιδιότητες εξίσου καλές με αυτές του παρθένου γραφενίου. Το χαμηλό κόστος της σύνθεσης και ο καλύτερος έλεγχος των συνθηκών αντίδρασης έχουν κάνει το ασκορβικό οξύ ιδανικό αναγωγικό παράγοντα για τη σύνθεση rGO (4).
Το rGO συντίθεται με το ενδιαφέρον να αποκτηθούν οι ίδιες ηλεκτρονικές ιδιότητες του παρθένου γραφενίου. Ταυτόχρονα, η αναγωγή του GO σε rGO προκαλεί αυξημένη υδροφοβία λόγω μειωμένων λειτουργικών ομάδων οξυγόνου που τελικά οδηγεί σε συσσωμάτωση. Η χαμηλότερη σταθερότητα του νερού επηρεάζει την εφαρμογή του σε βιοϊατρικές εφαρμογές. Η λειτουργικότητα της επιφάνειας rGO είναι ένας τρόπος απόκτησης σταθερού υδατικού εναιωρήματος του rGO με το πρόσθετο πλεονέκτημα της μείωσης της τοξικότητας και της βελτίωσης της συμβατότητας με τα ζωντανά κύτταρα (5). Τασιενεργά και πολυμερή, όπως η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), η δεξτράνη, η πολυβινυλική αλκοόλη, το πλουρονικό κ.λπ., χρησιμοποιούνται ευρέως για λειτουργικοποιήσεις. Η λειτουργικοποίηση της επιφάνειας με ένα πλουρονικό, δομικό συμπολυμερές τριών συστάδων που αποτελείται από πολυ(αιθυλενοξείδιο)-μπλοκ-πολυ(προπυλενοξείδιο)-μπλοκ-πολυ- (αιθυλενοξείδιο) αποδίδει μια σημαντικά σταθερή διασπορά του rGO στο νερό (6).
Η αναγωγή με ασκορβικό οξύ του GO σε rGO και η επακόλουθη λειτουργικοποίηση χρησιμοποιώντας pluronics παρήγαγαν ένα σταθεροποιημένο με pluronics rGO με απόδοση πάνω από 80%. Ο χαρακτηρισμός των συντιθέμενων pluronics σταθεροποίησε το rGO χρησιμοποιώντας διαφορετικές τεχνικές όπως FT-IR, XRD, φασματοσκοπία Raman, XPS, TGA, TEM και XPS επιβεβαίωσε την επιτυχή αναγωγή του GO σε rGO καθώς και την αποτελεσματική σύζευξη των pluronics στην επιφάνεια rGO. Εκτός από τον φυσικοχημικό χαρακτηρισμό, ζωτικής σημασίας είναι και ο βιολογικός χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων.
Η ανίχνευση ενδοτοξίνης είναι μια σημαντική τεχνική βιολογικού χαρακτηρισμού για τα νανοσωματίδια. Τα νανοσωματίδια πρέπει να είναι απαλλαγμένα από ενδοτοξίνες πριν από τις βιολογικές αναλύσεις, καθώς η παρεμβολή της ενδοτοξίνης μπορεί να δώσει ψευδή αποτελέσματα. Η αξιολόγηση της ενδοτοξίνης του rGO και του σταθεροποιημένου με pluronics rGO αποκάλυψε ότι το όριο ενδοτοξίνης και για τα δύο νανοσωματίδια ήταν μικρότερο από το συνιστώμενο επίπεδο ενδοτοξίνης του USP για φάρμακα και ιατροτεχνολογικά προϊόντα (0,5 EU/ml). Ως εκ τούτου, τόσο το rGO όσο και το σταθεροποιημένο με pluronics rGO είναι ενδεδειγμένο για βιοϊατρικές εφαρμογές μετά από μια πιο ενδελεχή έρευνα.
Ο σχηματισμός πρωτεϊνικού κορώνα καθορίζει την τύχη του νανοσωματιδίου όταν χορηγείται μέσα στο σώμα και θεωρείται ως σημαντική τεχνική βιολογικού χαρακτηρισμού (7). Οι πρωτεΐνες και τα βιομόρια απορροφώνται στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων σύμφωνα με το φαινόμενο Vroman, σχηματίζοντας ένα σκληρό και μαλακό στέμμα. Η πρωτεϊνική κορώνα που σχηματίζεται καθορίζει τη βιολογική απόκριση της κυκλοφορίας, του μεταβολισμού και της απέκκρισης των νανοσωματιδίων. Η ανάλυση SDS του rGO και των σταθεροποιημένων με pluronics νανοσωματιδίων αποκάλυψε ότι το rGO είχε μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης πρωτεΐνης. Δεν παρατηρήθηκαν συγκεκριμένες ζώνες σε σταθεροποιημένο με pluronics rGO, υποδηλώνοντας χαμηλή προσρόφηση πρωτεΐνης. Η χαμηλή απορρόφηση πρωτεΐνης μπορεί να αποδοθεί στην παρουσία τμήματος PEG στα pluronics. Το PEG προκαλεί χαμηλότερη δέσμευση πρωτεϊνών και καθιστά δυνατή τη διείσδυση μέσω του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (8).
Ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός (BBB) είναι ένας σημαντικός περιορισμός που προστατεύει το νευρικό σύστημα. Ταυτόχρονα, το BBB εμποδίζει την παροχή φαρμάκου στη νευρωνική θέση. Η ικανότητα των νανοσωματιδίων να διασχίζουν το BBB τα καθιστά αξιόπιστα για διάφορες νευρωνικές εφαρμογές (Εικόνα 1).
Το γραφένιο, σύμφωνα με τις αντανακλάσεις της βιβλιογραφίας, είναι το βέλτιστο για χορήγηση φαρμάκων, εν τω βάθει εγκεφαλική διέγερση, στοχευμένη θεραπεία κ.λπ. (9). Είναι ελκυστικό ότι το γραφένιο έχει διερευνηθεί ευρέως για τη δυνατότητα φωτοθερμικής θεραπείας της νόσου του Alzheimer (10). Εκτός από την ικανότητα να διασχίζει το BBB, το γραφένιο μπορεί επίσης να προκαλέσει πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων σε νευρώνες, μια ιδιότητα θεμελιώδης για την αναγέννηση των νευρώνων. Η επικύρωση της βιοσυμβατότητας του γραφενίου είναι απαραίτητη πριν από τη χρήση του σε βιοϊατρικές εφαρμογές. Το rGO, καθώς και το σταθεροποιημένο με pluronics rGO, πρέπει να επισημαίνονται ως ασφαλή έναντι οποιωνδήποτε νευροφυσιολογικών αλλαγών που προκαλούνται από σωματίδια. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα PC-12, μια κυτταρική σειρά φαιοχρωμοκυτώματος αρουραίου, επιλέχθηκαν για να αναλυθεί η επίδραση τόσο του rGO όσο και του σταθεροποιημένου με pluronics rGO (Εικόνα 2).
Το PC-12 έχει την ικανότητα να διαφοροποιεί τους νευρώνες ως απόκριση στον αυξητικό παράγοντα νεύρων (NGF). Η ανάλυση ανάλυσης MTS έδειξε δοσοεξαρτώμενη τοξικότητα όταν τα κύτταρα PC-12 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με rGO και σταθεροποιημένο με pluronics rGO. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), η rGO προκάλεσε διαταραχή της μεμβράνης όπως φαίνεται από την αυξημένη απελευθέρωση LDH. Από την άλλη πλευρά, η σταθεροποιημένη με pluronics rGO δεν προκάλεσε καμία αξιοσημείωτη αύξηση στην απελευθέρωση LDH. Έτσι, μπορεί να συναχθεί ότι η σταθεροποίηση του pluronics μείωσε την τάση καταστροφής της μεμβράνης του rGO.
Η κυτταροσκελετική ακεραιότητα των κυττάρων PC-12 που έχουν υποστεί αγωγή με rGO και τα σταθεροποιημένα με pluronics rGO αναλύθηκαν με χρώση β-ΙΙΙ τουμπουλίνης. Η rGO προκάλεσε κυτταροσκελετική διαταραχή σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Δεν ανιχνεύθηκε εμφανής κυτταροσκελετική διαταραχή σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με σταθεροποιημένο με pluronics rGO. Το οξειδωτικό στρες είναι ο κύριος παράγοντας που συμβάλλει στην τοξικότητα που προκαλείται από νανοσωματίδια.
Για το λόγο αυτό, η παραγωγή ROS που προκαλείται από νανοσωματίδια πρέπει να παρακολουθείται για να έχουμε μια ιδέα σχετικά με τη σχετική τοξικότητά της. Το rGO δεν ενέκρινε τη δημιουργία ROS σε κύτταρα PC-12. Η υδροφοβικότητα του rGO περιορίζει την αλληλεπίδρασή του με τα κύτταρα. Αυτός θα μπορούσε να είναι ο λόγος για χαμηλότερη ανίχνευση ROS σε κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με rGO. Η συμπεριφορά ριζικής δέσμευσης του γραφενίου βοηθά επίσης στη μείωση της παραγωγής ROS (11). Τα κύτταρα PC-12 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με σταθεροποιημένο με πλουρονικό rGO έδειξαν υψηλότερη ποσότητα ROS σε σύγκριση με κύτταρα που δεν είχαν υποστεί αγωγή. Η κολλοειδής σταθερότητα του σταθεροποιημένου με πλουρονικό rGO διευκολύνει καλύτερες κυτταρικές αλληλεπιδράσεις που προκαλούν απόκριση αύξηση του ROS με αυξανόμενες συγκεντρώσεις δόσης (Εικόνα 3).
Εκτός από τοin vitro μοντέλο, η επίδραση του rGO και του σταθεροποιημένου με pluronics rGO στο in vivo επίπεδο αναλύθηκε επίσης. Σε ποντίκια Swiss Albino χορηγήθηκαν συγκεντρώσεις 10 mg/ml rGO και σταθεροποιημένου με pluronics rGO τόσο με ενδοφλέβια (i.v) όσο και με ενδοπεριτοναϊκή (i.p) οδό. Το rGO και το σταθεροποιημένο με pluronics rGO δεν προκάλεσαν καμία ανιχνεύσιμη τοξικότητα έως και 72 ώρες μετά τη χορήγηση. Δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές συμπεριφοράς ή απώλεια βάρους σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία.
Τα αποτελέσματα προτείνουν μια φιλική προς το περιβάλλον, αξιόπιστη και χαμηλού κόστους διαδρομή για την επίτευξη σταθερής διασποράς rGO μέσω σταθεροποίησης pluronics. Αν και το νανοσωματίδιο έδειξε δοσοεξαρτώμενη τοξικότητα στο in vitro επίπεδο, δεν ανιχνεύθηκε ουσιαστική τοξικότητα στο in vivo επίπεδο. Το προτεινόμενο υλικό πρέπει να εξεταστεί περαιτέρω για επαναλαμβανόμενη έκθεση για να έχουμε μια σαφέστερη εικόνα του πεδίου εφαρμογής του στις βιοϊατρικές εφαρμογές.
