Ρύθμιση της παραγωγής τακρόλιμους σε είδη Streptomyces

Στρεπτομύκητες τα είδη είναι βακτήρια που αναπτύσσονται στο έδαφος

Αυτά τα βακτήρια είναι από τους πιο άφθονους οργανισμούς στο έδαφος. Είναι ετερότροφα, δηλ. αποσυνθέτουν την οργανική ύλη άλλων ζωντανών όντων (όπως τα φυτά). Η μορφολογία και ο τρόπος ζωής τους μοιάζει με αυτόν των μυκήτων:νηματώδη κύτταρα που αναπτύσσονται από τις άκρες και διεισδύουν στα υποστρώματα, εκκρίνοντας υδρολυτικά ένζυμα για να αποσυνθέσουν δομές μεγάλων κυττάρων ή οργανικά μόρια.

Όπως συμβαίνει με τους μύκητες, τα Streptomyces Τα νημάτια διαφοροποιούνται σε σπόρια όταν οι περιβαλλοντικές συνθήκες δεν υποστηρίζουν πλέον την ανάπτυξη. Τα σπόρια είναι μια εξειδικευμένη κυτταρική μορφή που επιβιώνει μέχρι να εμφανιστούν ευνοϊκές συνθήκες ανάπτυξης.

Το έδαφος είναι ένα πολύ πολυσύχναστο μέρος για να ζεις και παρουσιάζει δραστικές διακυμάνσεις στις συνθήκες ανάπτυξης

Η έναρξη της σπορίωσης συνήθως συνδέεται με την παραγωγή αντιβιοτικών. Αυτές οι ενώσεις φαίνεται να χρησιμεύουν σε βακτήρια που σχηματίζουν σπόρους ως χημικά όπλα για την προστασία της αποικίας από ανταγωνιστές βακτηρίων ή μυκήτων κατά τη διάρκεια αυτού του ευαίσθητου σταδίου. Τα αντιβιοτικά μπορεί επίσης να λειτουργήσουν ως μόρια σηματοδότησης για την επικοινωνία από κύτταρο σε κύτταρο. Σε κάθε περίπτωση, περίπου τα δύο τρίτα όλων των γνωστών αντιβιοτικών παράγονται από είδη Streptomyces γένος, επομένως η ιατρική σημασία αυτού του βακτηρίου. Επιπλέον, ορισμένες από τις ενώσεις που σχετίζονται με αντιβιοτικά παρουσιάζουν άλλες χρήσιμες βιοδραστηριότητες, όπως αντικαρκινικές, εντομοκτόνες ή ανοσοκατασταλτικές δραστηριότητες.

Η ρύθμιση της παραγωγής αντιβιοτικών είναι σημαντική τόσο από βακτηριακή όσο και από ανθρώπινη άποψη

Τα αντιβιοτικά είναι ακριβά για το κύτταρο επειδή είναι πολύπλοκες δομές των οποίων η βιοσύνθεση απαιτούσε ενέργεια και θρεπτικά συστατικά. Έτσι, τα αντιβιοτικά παράγονται από το Streptomyces μόνο όταν χρειάζεται, όπως όταν τα θρεπτικά συστατικά είναι σπάνια και αρχίζει η σπορίωση.

Δεν είναι παράξενο ότι όταν οι περιβαλλοντικές συνθήκες ευνοούν την ανάπτυξη, π.χ., δεν ξεκινά η αφθονία άνθρακα και πηγών ενέργειας όπως σάκχαρα, σπορίωση και παραγωγή αντιβιοτικών. Όσον αφορά τις εργαστηριακές καλλιέργειες, ένα μέσο ανάπτυξης με πλούσιο σε πηγές άνθρακα είναι καλό για την ανάπτυξη βακτηρίων αλλά κακό για την παραγωγή αντιβιοτικών. Τα θρεπτικά συστατικά που ευνοούν την ανάπτυξη είναι επιβλαβή για την παραγωγή αντιβιοτικών. Η παραδειγματική περίπτωση είναι η γλυκόζη. Η γλυκόζη μπορεί εύκολα να χρησιμοποιηθεί από το μεταβολισμό των κυττάρων των περισσότερων οργανισμών και να υποστηρίξει μια καλή ανάπτυξη, αλλά συνήθως καταστέλλει την παραγωγή αντιβιοτικών. Αυτή είναι μια πτυχή του ρυθμιστικού φαινομένου που ονομάζεται καταστολή του άνθρακα.

Στρεπτομύκητες tsukubensis (ή tsukubaensis ) είναι σημαντικό βιομηχανικό είδος

Λόγω του ενδιαφέροντος της παραγωγής αντιβιοτικών ανά είδος, το γένος έχει αποτελέσει το επίκεντρο πολλών εργασιών σε ρυθμιστικά θέματα. Οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες έχουν διεξαχθεί στο πρότυπο είδος Streptomyces coelicolor . Αυτό το είδος στερείται βιομηχανικής σημασίας, ωστόσο, χρησιμοποιείται ως μοντέλο πριν από δεκαετίες, επειδή παράγει δύο χρωματισμένα αντιβιοτικά, την ακτινοροδίνη και την ενδεκυλοπροδιγιονσίνη, που αναγνωρίζονται εύκολα οπτικά:οι αποικίες σε πλάκες και επίσης οι υγρές καλλιέργειες γίνονται κοκκινωπές (undecylprodigionsin) ή μπλε (ακτινοροδίνη, "coelicolor" σημαίνει χρώμα του ουρανού).

Για την τρέχουσα εργασία, επικεντρώσαμε τις προσπάθειές μας στον παραγωγό τακρόλιμους (ή FK506). Αυτή η ένωση παρουσιάζει κάποια αντιμυκητιακή δράση, αλλά η ιατρική της χρησιμότητα βασίζεται στην ανοσοκατασταλτική της δράση. Η τακρόλιμους χρησιμοποιείται ευρέως για την πρόληψη της απόρριψης μοσχεύματος. επίσης στη θεραπεία δερματικών παθήσεων και παρουσιάζει πιθανές ιδιότητες ως νευροπροστατευτικός, νευροαναγεννητικός και αντικαρκινικός παράγοντας.

Η γλυκόζη και η γλυκερίνη προκάλεσαν την καταστολή της παραγωγής τακρόλιμους

Πρωταρχικό μας ενδιαφέρον είναι η μελέτη της ρύθμισης της παραγωγής τακρόλιμους. Για αυτήν την εργασία, μας ενδιέφερε η καταστολή του καταβολίτη άνθρακα. Αυτό που κάναμε πρώτα ήταν να καθορίσουμε ποιες πηγές άνθρακα και σε ποια συγκέντρωση προκάλεσαν την καταστολή της τακρόλιμους. Στο μέσο και στις συνθήκες που χρησιμοποιούνται για τις υγρές καλλιέργειες, η τακρόλιμους παράγεται μετά τον περιορισμό της ανάπτυξης από την εξάντληση των φωσφορικών αλάτων (περίπου 89 ώρες καλλιέργειας· τα φωσφορικά είναι η μόνη πηγή βασικού θρεπτικού φωσφόρου).

Δοκιμάσαμε την επίδραση στην παραγωγή τακρόλιμους από την προσθήκη διαφορετικών πηγών άνθρακα. Δοκιμάσαμε την προσθήκη σε 70 ώρες καλλιέργειας, κοντά στο τέλος μιας φάσης ταχείας ανάπτυξης και πριν από την έναρξη της παραγωγής τακρόλιμους. Βρήκαμε ότι η προσθήκη γλυκόζης εμπόδισε εντελώς την παραγωγή (καθ' όλη τη διάρκεια της πορείας των καλλιεργειών, 9 και μισή ημέρες). Η προσθήκη γλυκερίνης οδήγησε επίσης σε ισχυρή καταστολή, αν και όχι πλήρη. Εν τω μεταξύ, η μαλτόζη, ένας δισακχαρίτης της γλυκόζης, δεν επηρέασε την παραγωγή.

Έτσι, καθιερώθηκε η πειραματική διάταξη:πραγματοποιήσαμε μια μεταγραφική ανάλυση χρησιμοποιώντας καλλιέργειες χρονοσειρών με προσθήκη γλυκόζης, γλυκερόλης ή μαλτόζης, η τελευταία ως έλεγχος (χωρίς συνθήκη καταστολής). Η μεταγραφική μας επιτρέπει να μελετήσουμε τη μεταγραφή των γονιδίων, δηλαδή ένα ενδιάμεσο βήμα από τα γονίδια στις πρωτεΐνες. Το DNA μεταγράφεται σε RNA, το μεγαλύτερο μέρος του οποίου μεταφράζεται σε πρωτεΐνες σε ένα περαιτέρω βήμα. Έτσι, μπορούμε να προσδιορίσουμε ποια γονίδια μεταγράφονται περισσότερο ή λιγότερο σε μια συγκεκριμένη πειραματική συνθήκη.

Για μεταγραφικές μελέτες, χρησιμοποιήσαμε τεχνολογία μικροσυστοιχιών. Οι μικροσυστοιχίες αποτελούνται από χιλιάδες σύντομες αλληλουχίες DNA, που ονομάζονται ανιχνευτές, στερεωμένες σε μια στερεή επιφάνεια. Οι αλληλουχίες ανιχνευτών αντιπροσωπεύουν διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος. Συμπληρωματικές αλληλουχίες DNA που λαμβάνονται από κύτταρα κάθε πειραματικής συνθήκης στερεώνονται σε ανιχνευτές με υβριδισμό. Η ποσότητα του υβριδοποιημένου DNA μετράται μέσω φθορισμού.

Προφίλ μεταγραφής σε όλο το γονιδίωμα αποκαλύπτουν υποδείξεις για τους πολύπλοκους ρυθμιστικούς μηχανισμούς

Δείγματα των καλλιεργειών ελήφθησαν σε ορισμένα χρονικά σημεία. Ολικό RNA καθαρίστηκε από τα κύτταρα και τα παρασκευάσματα RNA επισημάνθηκαν και υβριδοποιήθηκαν έναντι μικροσυστοιχιών. Τα προκύπτοντα προφίλ των γονιδίων που κωδικοποιούν τα βιοσυνθετικά ένζυμα αντανακλούσαν τα χαρακτηριστικά παραγωγής των καλλιεργειών. Έτσι, σε καλλιέργειες με προσθήκη μαλτόζης, η έκφραση των βιοσυνθετικών γονιδίων συμπίπτει με το χρόνο εμφάνισης του tacrolimus στην καλλιέργεια. Αντίθετα, σε καλλιέργειες γλυκόζης και γλυκερίνης δεν υπήρχε έκφραση των βιοσυνθετικών γονιδίων.

Δεδομένου ότι η έλλειψη παραγωγής τακρόλιμους σε συνθήκες καταστολής προκλήθηκε από την έλλειψη γονιδιακής έκφρασης, τα ρυθμιστικά γονίδια που 1) ήταν ενεργά μόνο σε κατάσταση μαλτόζης και 2) η έκφρασή του ενεργοποιήθηκε εκ των προτέρων σε σχέση με εκείνη των βιοσυνθετικών γονιδίων, θα μπορούσαν να είναι θετικοί ρυθμιστές της γονίδια βιοσύνθεσης tacrolimus. Αυτή είναι η περίπτωση του fkbN , ένα γονίδιο που βρίσκεται στην ίδια χρωμοσωμική περιοχή με αυτή των γονιδίων βιοσύνθεσης, το σύμπλεγμα βιοσύνθεσης. Αυτό το γονίδιο είναι πολύ γνωστό ότι κωδικοποιεί την απαιτούμενη πρωτεΐνη ενεργοποιητή μεταγραφής η οποία ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων βιοσύνθεσης. Μέσω της μέτρησης της συσχέτισης Pearson μεταξύ των μεταγραφικών τιμών, εντοπίσαμε άλλα γονίδια που εμφανίζουν παρόμοια προφίλ μεταγραφής με αυτό του fkbN . Έως 80 γονίδια τα προφίλ των οποίων συσχετίστηκαν με αυτά του fkbN βρέθηκαν και μπορεί να είναι χρήσιμοι υποψήφιοι για τη γενετική μηχανική του στελέχους για την αύξηση της παραγωγής.

Ένα πλήθος γονιδίων και λειτουργιών επηρεάστηκαν από την προσθήκη της πηγής άνθρακα. Για να είμαστε πολύ σύντομοι, μπορούμε να πούμε ότι όχι μόνο τα γονίδια για την παραγωγή τακρόλιμους αλλά και τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη μορφολογική διαφοροποίηση ήταν έντονα και μόνιμα υπορυθμισμένα, όπως αναμενόταν.

Στρεπτομύκητες είναι ένα ποικιλόμορφο γένος με περίπου 600 είδη που χαρακτηρίζονται. Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένες παρατηρούμενες γονιδιακές αποκρίσεις σε κατασταλτικές πηγές άνθρακα ήταν διαφορετικές μεταξύ του S. tsukubensis και αυτά που παρατηρήθηκαν προηγουμένως στο πρότυπο είδος S. coelicolor . Αυτές οι αποκλίσεις ενισχύουν τη σημασία της χρήσης διακριτών και βιομηχανικά σημαντικών Streptomyces είδη για ρυθμιστικές μελέτες, οι οποίες είναι χρήσιμες όχι μόνο για την ανακάλυψη νέων αντιβιοτικών αλλά και για τη βελτίωση των αποδόσεων παραγωγής ήδη γνωστών βιοδραστικών ενώσεων.

Αυτά τα ευρήματα περιγράφονται στο άρθρο με τίτλο Streptomyces tsukubaensis ως νέο μοντέλο για καταστολή άνθρακα:μεταγραφική απόκριση στις πηγές άνθρακα που καταστέλλει την τακρόλιμους, που δημοσιεύθηκε πρόσφατα στο περιοδικό Applied Microbiology and Biotechnology. Αυτή η εργασία διεξήχθη από τους M. Ordóñez-Roblez, F. Santos-Beneit, S. M. Albillos, P. Liras, J. F. Martín και A. Rodríguez-García από το Instituto de Biotecnología de León, INBIOTEC.