Πώς χρησιμοποιούνται τα ένζυμα περιορισμού για την παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA

Το ανασυνδυασμένο DNA είναι ένας τεχνητός τύπος DNA που παράγεται με συνδυασμό DNA δύο ή περισσότερων ειδών. Η διαδικασία παραγωγής ανασυνδυασμένου DNA είναι γνωστή ως μοριακή κλωνοποίηση. Η βασική διαδικασία της μοριακής κλωνοποίησης περιλαμβάνει απομόνωση DNA, κοπή DNA, ένωση DNA και ενίσχυση του ανασυνδυασμένου DNA. Το γονίδιο ενδιαφέροντος εισάγεται στον φορέα, ο οποίος χρησιμεύει ως μόριο φορέας για το γονίδιο ενδιαφέροντος. Ο φορέας, μαζί με το γονίδιο ενδιαφέροντος, αναφέρεται στο ανασυνδυασμένο DNA. Ο κύριος ρόλος των περιοριστικών ενζύμων στην κλωνοποίηση γονιδίων είναι η κοπή του DNA. Το βασικό χαρακτηριστικό των περιοριστικών ενζύμων που τα καθιστά κατάλληλα για χειρισμό του DNA είναι ότι κόβουν το DNA σε συγκεκριμένους στόχους. Αυτό επιτρέπει την παραγωγή επιθυμητών θραυσμάτων DNA για το σκοπό σύνδεσης.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι τα ένζυμα περιορισμού
     – Ορισμός, Ιδιότητες, Ρόλος
2. Πώς χρησιμοποιούνται τα ένζυμα περιορισμού για την παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA
     – Κλωνοποίηση γονιδίων, χρήση περιοριστικών ενζύμων στην κλωνοποίηση γονιδίων

Βασικοί όροι:κοπή DNA, γονιδιακή κλωνοποίηση, γονίδιο ενδιαφέροντος, μοριακή κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA, ένζυμα περιορισμού, φορέας

Τι είναι τα ένζυμα περιορισμού

Ένα ένζυμο περιορισμού είναι μια ενδονουκλεάση που αναγνωρίζει σύντομες, συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA γνωστές ως θέσεις περιορισμού και διασπά το DNA σε αυτήν τη θέση. Είναι ένα είδος βιοχημικού ψαλιδιού που παράγεται από βακτήρια. Τα ένζυμα περιορισμού προστατεύουν τα βακτήρια από τους βακτηριοφάγους. Αυτά τα ένζυμα απομονώνονται από βακτήρια και χρησιμοποιούνται για την κοπή DNA στο εργαστήριο. Η δράση ενός περιοριστικού ενζύμου φαίνεται στο σχήμα 1.

Εικόνα 1:Δράση του HindIII

Η ικανότητα των περιοριστικών ενζύμων να κόβουν το DNA σε ακριβείς τοποθεσίες επιτρέπει στους ερευνητές να απομονώνουν θραύσματα που περιέχουν γονίδια από το γονιδιωματικό DNA. Αυτά τα θραύσματα μπορούν να εισαχθούν σε φορείς για την παραγωγή ανασυνδυασμένων μορίων DNA.

Πώς χρησιμοποιούνται τα ένζυμα περιορισμού για την παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA

Το ανασυνδυασμένο DNA είναι ένα μόριο DNA που αποτελείται από DNA δύο ή περισσότερων ειδών. Περιλαμβάνει κυρίως ένα γονίδιο ενδιαφέροντος από ένα είδος δότη και έναν φορέα που μεταφέρει το γονίδιο ενδιαφέροντος στο κύτταρο ξενιστή. Τα κύρια στάδια της παραγωγής μορίων ανασυνδυασμένου DNA είναι η απομόνωση DNA, η πέψη με ένζυμα περιορισμού, η απολίνωση του γονιδίου που ενδιαφέρει τον φορέα και η ενίσχυση του μορίου ανασυνδυασμένου DNA μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή. Η όλη διαδικασία είναι γνωστή ως μοριακή κλωνοποίηση . Η μοριακή κλωνοποίηση φαίνεται στο σχήμα 2 .

Εικόνα 2:Μοριακή κλωνοποίηση

Το γονίδιο ενδιαφέροντος απομονώνεται πρώτα από βιολογικά δείγματα με τη μορφή γονιδιωματικού DNA ή μπορεί να ενισχυθεί με PCR. Μερικές φορές, το γονίδιο ενδιαφέροντος μπορεί να υπάρχει μέσα σε έναν φορέα. Για να εισαχθεί στον φορέα που είναι κατάλληλος να μεταφέρει το γονίδιο ενδιαφέροντος στο κύτταρο ξενιστή, θα πρέπει να αποκοπεί από το μητρικό μόριο. Καθώς τα περιοριστικά ένζυμα κόβουν με ακρίβεια το DNA αναγνωρίζοντας θέσεις περιορισμού, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σκοπό αυτό. Το γονίδιο ενδιαφέροντος και ο φορέας μπορούν να υποστούν πέψη με το ίδιο ένζυμο περιορισμού ή κάθε άκρο του γονιδίου ενδιαφέροντος μπορεί να χωνευθεί από δύο ένζυμα περιορισμού. Αυτή η πέψη παράγει συμβατά άκρα για τη σύνδεση του γονιδίου που ενδιαφέρει τον φορέα. Η πέψη με δύο περιοριστικά ένζυμα επιτρέπει την απολίνωση των θραυσμάτων στον επιθυμητό προσανατολισμό Μετά την απολίνωση, τα προκύπτοντα μόρια ανασυνδυασμένου DNA μετασχηματίζονται σε βακτήρια για να παραχθεί ένας μεγάλος αριθμός αντιγράφων.

Συμπέρασμα

Τα ένζυμα περιορισμού είναι ενδονουκλεάσες που κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες τοποθεσίες που ονομάζονται περιοριστικές θέσεις. Οι ιδιότητες των περιοριστικών ενζύμων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή ανασυνδυασμένων μορίων DNA κόβοντας το DNA σε ακριβείς θέσεις. Το ανασυνδυασμένο DNA γενικά περιέχει ένα γονίδιο ενδιαφέροντος που εισάγεται σε έναν φορέα.

Αναφορά:

1. «Ορισμός του ενζύμου περιορισμού». MedicineNet, Διαθέσιμο εδώ.
2. Griffiths, Anthony JF. «Δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA». Εισαγωγή στη Γενετική Ανάλυση. 7th edition., U.S. National Library of Medicine, 1 Ιανουαρίου 1970, Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "HindIII Restriction site and sticky ends vector" By Helixitta – Δική εργασία (CC BY-SA 4.0) μέσω Commons Wikimedia
2. "Construct" By Joyxi – Δική μου εργασία (Δημόσιος Τομέας) μέσω Commons Wikimedia