Γιατί χρησιμοποιείται η PCR στη διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας DNA

Η αλληλουχία DNA είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Η αλληλουχία Sanger και η αλληλουχία επόμενης γενιάς είναι δύο τύποι μεθόδων αλληλούχισης. Φθορίζοντες δείκτες χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση κάθε νουκλεοτιδίου στην αλληλουχία. Η PCR χρησιμοποιείται για την ενσωμάτωση των φθοριζόντων δεικτών στο θραύσμα DNA. Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο για την παραγωγή εκατομμυρίων αντιγράφων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Η ανάλυση των θραυσμάτων PCR στο πήκτωμα επιτρέπει τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του θραύσματος DNA.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι η Αλληλουχία
     – Ορισμός, Τύποι αλληλουχίας – Αλληλουχία επόμενης γενιάς, Αλληλουχία Sanger
2. Γιατί χρησιμοποιείται η PCR στη διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας DNA
    – Ενσωμάτωση φθοριζόντων χρωστικών κατά τη διάρκεια της PCR

Βασικοί όροι:ddNTPs, dNTPs, DNA Sequencing, Fluorescent Dyes, Next Generation Sequencing, PCR, Sanger Sequencing

Τι είναι η αλληλουχία

Η αλληλούχιση είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός μορίου DNA. Η αλληλούχιση Sanger και η αλληλουχία επόμενης γενιάς είναι οι δύο κύριες μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Και οι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA εμπλέκονται στην ενσωμάτωση φθοριζόντων παραγόντων στον κλώνο DNA με PCR για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός συγκεκριμένου κλώνου DNA.

Sanger Sequencing

Η πρώτη μέθοδος αλληλουχίας, η οποία είναι γνωστή ως αλληλουχία Sanger, αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τον Fredric Sanger το 1975. Κατά συνέπεια, είναι γνωστή ως αλληλουχία Sanger. Η αλληλουχία Sanger εμπλέκεται στην επιλεκτική ενσωμάτωση διδεοξυνουκλεοτιδίων που τερματίζουν την αλυσίδα (ddNTPS) από την DNA πολυμεράση κατά τη διάρκεια in vitro σύνθεση DNA. Ως εκ τούτου, είναι επίσης γνωστή ως μέθοδος τερματισμού αλυσίδας. Τα κανονικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) χρησιμοποιούνται για την επιμήκυνση του κλώνου του DNA. ddNTPs προστίθενται επίσης στο μίγμα αντίδρασης για τον τερματισμό της ανάπτυξης της αλυσίδας. Οι τέσσερις τύποι ddNTP προστίθενται σε τέσσερα ξεχωριστά μείγματα PCR. Επομένως, πραγματοποιούνται τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις PCR προσθέτοντας ddATP, ddGTP, ddCTP και ddTTP. Για κάθε μίγμα αντίδρασης, ένας μοναδικός τύπος προστιθέμενου ddNTP (εάν προστεθεί ddATP), η ανάπτυξη διαφορετικών αμπλικονίων τερματίζεται σε κάθε (Α) νουκλεοτίδιο στο θραύσμα DNA. Στη συνέχεια οι τέσσερις αντιδράσεις διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Ο εκπεμπόμενος φθορισμός ανιχνεύεται από ένα φθορόμετρο. Η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των θραυσμάτων που χρησιμοποιούνται στην κλωνοποίηση DNA και των θραυσμάτων που ενισχύονται με PCR. Η γενική διαδικασία της αλληλουχίας Sanger φαίνεται στην εικόνα 1 .

Εικόνα 1:Γενική διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger

Αλληλουχία επόμενης γενιάς

Η αλληλουχία επόμενης γενιάς είναι το συλλογικό όνομα για τις πιο πρόσφατες τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Πολλές αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας εκτελούνται σε μικροκλίμακα σε ένα τσιπ ταυτόχρονα στον προσδιορισμό αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Και οι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας χρησιμοποιούν επισημασμένα νουκλεοτίδια με φθορισμό που ενσωματώνονται στο αμπλικόνιο κατά τη διάρκεια της PCR, επιτρέποντας τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Η προσθήκη φθοριζόντων δεικτών τερματισμού της αλυσίδας εμπλέκεται επίσης στον προσδιορισμό αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Ωστόσο, η κύρια διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας Sanger και της αλληλουχίας επόμενης γενιάς είναι η χρήση τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης για τον διαχωρισμό διαφορετικών επισημασμένων αμπλικονίων στον προσδιορισμό αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Η τριχοειδική ηλεκτροφόρηση είναι μια αναλυτική μέθοδος διαχωρισμού με την οποία τα μόρια διαχωρίζονται με βάση την ηλεκτροφορητική κινητικότητά τους.

Γιατί χρησιμοποιείται η PCR στη διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας DNA

Κατά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας, θα πρέπει να ενσωματώνονται φθορίζοντες δείκτες στον κλώνο DNA για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Αυτή η ενσωμάτωση λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της PCR. Γενικά, οι τέσσερις τύποι dNTP ενσωματώνονται στον κλώνο DNA που πρόσφατα συντίθεται κατά τη διάρκεια της PCR. Αυτό το φαινόμενο χρησιμοποιείται στην αλληλουχία DNA για την ενσωμάτωση σημασμένων με φθορισμό διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs) στο αμπλικόνιο ενώ προσδιορίζεται η αλληλουχία DNA.

Γενικά, ένα μείγμα κανονικών τεσσάρων βάσεων (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) προστίθεται στο μείγμα αντίδρασης PCR κατά τη διάρκεια της αλληλουχίας DNA.

Επιπλέον, ένα από τα τέσσερα διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP και ddTTP) προστίθενται ως συστατικά της αντίδρασης PCR σε χαμηλή συγκέντρωση. Τέλος, πρέπει να πραγματοποιηθούν τέσσερις αντιδράσεις PCR για να προσδιοριστεί η πλήρης αλληλουχία.

Εικόνα 1:Καθορισμένη αλληλουχία DNA

Τα ddNTP δεν διαθέτουν ομάδα 3'-OH στο οποίο το εισερχόμενο νουκλεοτίδιο προστίθεται με DNA πολυμεράση. Ως εκ τούτου, η ενσωμάτωση του ddNTP τερματίζει την ανάπτυξη της αλυσίδας. Έτσι, σε καθεμία από τις τέσσερις αντιδράσεις PCR, ο τερματισμός της αλυσίδας λαμβάνει χώρα σε μια συγκεκριμένη βάση. Αυτά τα ddNTP είναι επίσης ενσωματωμένα με διαφορετικές φθορίζουσες βαφές (Το ddATP επισημαίνεται με πράσινη βαφή, το ddGTP επισημαίνεται με κίτρινη βαφή. το ddCTP επισημαίνεται με μπλε , και το ddTTP επισημαίνεται με κόκκινη βαφή ). Η ενσωμάτωση των φθοριζόντων χρωστικών και ο τερματισμός της αλυσίδας πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια της PCR. Τα αμπλικόνια εκτελούνται σε ένα πήκτωμα και το πήκτωμα σαρώνεται για τον φθορισμό από ένα φθορόμετρο στον αυτόματο προσδιοριστή αλληλουχίας για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων.

Συμπέρασμα

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας DNA είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Sanger και ο προσδιορισμός αλληλουχίας επόμενης γενιάς ενσωματώνουν διαφορετικές φθορίζουσες βαφές στο θραύσμα DNA για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων κατά τη διάρκεια μιας PCR.

Αναφορά:

1. Adams, Jill U. «Τεχνολογίες αλληλουχίας DNA». Nature News, Nature Publishing Group, Διαθέσιμο εδώ.
2."Αλληλουχία DNA – Αυτοματοποιημένος προσδιορισμός αλληλουχίας με φθορίζουσες χρωστικές." Άρθρα JRank, Διαθέσιμα εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. «Sanger sequencing – general» Автор:Χρήστης:Fibonachi – власна робота (CC BY-SA 1.0) μέσω Commons Wikimedia [τροποποιημένη] 2. «Ακολουθία DNA» Από Sjef – Ίδιο έργο (Δημόσιος Τομέας) μέσω Commons Wikimedia