Πώς λειτουργεί το Illumina Sequencing

Βασικοί όροι:Δημιουργία συμπλέγματος, Ανάλυση δεδομένων, Αλληλουχία Illumina, Προετοιμασία βιβλιοθήκης, Αλληλουχία κατά Σύνθεση

Τι είναι το Illumina Sequencing

Η τεχνολογία Illumina Sequencing ή sequencing-by-synthesis (SBS) είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνολογία αλληλουχίας επόμενης γενιάς στον κόσμο. Πάνω από το 90% των δεδομένων αλληλουχίας στον κόσμο παράγονται από την αλληλουχία Illumina. Αναπτύχθηκε αρχικά από τους Shankar Balasubramanian και David Klenerman στο Πανεπιστήμιο του Cambridge. Ίδρυσαν μια εταιρεία γνωστή ως Solexa το 1998. Στη συνέχεια, η Illumina αγόρασε τη Solexa το 2007, βελτιώνοντας γρήγορα την αρχική τεχνολογία. Ως εκ τούτου, η μέθοδος ονομάζεται επίσης μέθοδος αλληλουχίας Solexa/Illumina . Το κύριο πλεονέκτημα της αλληλουχίας Illumina είναι ότι παρέχει υψηλή απόδοση αναγνώσεων χωρίς σφάλματα.

Πώς λειτουργεί η αλληλουχία Illumina

Τα τέσσερα βήματα που εμπλέκονται στην αλληλουχία του Illumina περιγράφονται παρακάτω.

Βήμα 1. Προετοιμασία βιβλιοθήκης

• Μια βιβλιοθήκη αλληλουχίας προετοιμάζεται με ταυτόχρονη επισήμανση του DNA σε μικρά τμήματα των 200-600 ζευγών βάσεων από τρανσποζάσες σε μια διαδικασία γνωστή ως tagmentation, ακολουθούμενη από σύνδεση του προσαρμογέα στα δύο άκρα 3' και 5' των βραχέων τμημάτων του DNA.
• Πρόσθετα μοτίβα, όπως η θέση σύνδεσης εκκινητών αλληλουχίας, ο δείκτης και μια περιοχή, η οποία είναι συμπληρωματική του ολίγου κυττάρου ροής, προστίθενται στον προσαρμογέα και στις δύο πλευρές μέσω μειωμένης ενίσχυσης κύκλου . Η προσθήκη ετικετών και η προσθήκη μοτίβων φαίνονται στην εικόνα 1 .

Εικόνα 1:Προσθήκη ετικετών και προσθήκη μοτίβων

Βήμα 2. Δημιουργία συμπλέγματος

• Η προετοιμασμένη βιβλιοθήκη αλληλουχίας μετουσιώνεται και φορτώνεται σε ένα κελί ροής για δημιουργία συστάδων. Κατά τη δημιουργία συστάδων, κάθε θραύσμα στη βιβλιοθήκη αλληλουχίας ενισχύεται ισοθερμικά. Η κυψέλη ροής αποτελείται από λωρίδες που περιέχουν γυαλί. Κάθε λωρίδα είναι επικαλυμμένη με δύο τύπους ολιγονουκλεοτιδίων. Ο ένας τύπος είναι συμπληρωματικός στην περιοχή 5' των πρόσθετων μοτίβων και ο άλλος τύπος είναι συμπληρωματικός στην περιοχή 3' των πρόσθετων μοτίβων της προετοιμασμένης βιβλιοθήκης. Ως εκ τούτου, αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια συνδέονται με τις αντίστοιχες περιοχές του DNA στη βιβλιοθήκη αλληλουχίας. Η κυψέλη ροής με δύο τύπους ολιγογονιδίων φαίνεται στο σχήμα 2 . Το ολίγο που συνδέεται με την περιοχή 5' της βιβλιοθήκης αλληλουχίας έχει ροζ χρώμα, ενώ το ολίγο που συνδέεται με την περιοχή 3' της βιβλιοθήκης αλληλουχίας έχει πράσινο χρώμα.

Εικόνα 2:Κυψέλη ροής

• Μόλις η μονόκλωνη βιβλιοθήκη αλληλουχίας συνδεθεί με το ολίγο, ο συμπληρωματικός κλώνος δημιουργείται από την πολυμεράση DNA. Στη συνέχεια, το προκύπτον δίκλωνο DNA μετουσιώνεται και ο αρχικός κλώνος ξεπλένεται.
• Η κλωνική ενίσχυση του θραύσματος επιτυγχάνεται μέσω ενίσχυσης γέφυρας . Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, ο κλώνος διπλώνει πάνω από τον δεύτερο τύπο ολίγο στο κύτταρο ροής. Στη συνέχεια, η πολυμεράση συνθέτει τη δίκλωνη γέφυρα. Η μετουσίωση της γέφυρας έχει ως αποτέλεσμα δύο κλώνους DNA:τόσο προς τα εμπρός όσο και προς την αντίστροφη αλυσίδα στα ολίγο του κυττάρου ροής.
• Η ενίσχυση γέφυρας επαναλαμβάνεται ξανά και ξανά για να ληφθούν ταυτόχρονα εκατομμύρια ομάδες όλων των τύπων θραυσμάτων στη βιβλιοθήκη αλληλουχίας με κλωνική ενίσχυση. Η κλωνική ενίσχυση φαίνεται στην εικόνα 3 .

Εικόνα 3:Κλωνική ενίσχυση

• Στη συνέχεια, οι αντίστροφοι κλώνοι ξεπλένονται, διατηρώντας μόνο τους μπροστινούς κλώνους στο κελί ροής. Στο μπροστινό σκέλος, το άκρο 3′ είναι ελεύθερο και είναι μπλοκαρισμένο για να αποφευχθεί η ανεπιθύμητη πλήρωση.

Βήμα 3. Αλληλουχία

Πρώτη ανάγνωση της αντίστροφης ακολουθίας

• Η αλληλουχία ξεκινά με την επέκταση του πρώτου εκκινητή αλληλουχίας . Η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας Illumina χρησιμοποιεί τροποποιημένα dNTPs, τα οποία περιέχουν έναν τερματιστή στη θέση 3' του σακχάρου δεοξυριβόζης. Αυτά τα dNTP έχουν επίσης σήμανση φθορισμού σε διαφορετικά χρώματα.

• Μετά την προσθήκη κάθε συμπληρωματικού νουκλεοτιδίου, οι συστάδες στο κύτταρο ροής παρατηρούνται για την εκπομπή φθορισμού.

• Μετά την ανίχνευση φωτός, το φθοροφόρο μπορεί να ξεπλυθεί.

• Στη συνέχεια, η ομάδα τερματισμού της θέσης 3' του σακχάρου αναγεννάται από μια ομάδα υδροξυλίου, επιτρέποντας την προσθήκη ενός δεύτερου dNTP στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα. Αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως αλληλούχιση-από-σύνθεση. Η αλληλουχία ανά σύνθεση φαίνεται στο σχήμα 4.

Εικόνα 4:Αλληλουχία κατά σύνθεση

• Με την ολοκλήρωση της σύνθεσης, η πρώτη ανάγνωση της αντίστροφης ακολουθίας λαμβάνεται και το προϊόν προσδιορισμού αλληλουχίας ξεπλένεται.

Διαβασμένο ευρετήριο 1

• Ο εκκινητής δείκτη 1 στη συνέχεια υβριδοποιείται σε ομάδες για να δημιουργήσει μια δεύτερη ανάγνωση με τον ίδιο τρόπο με αλληλούχιση-σύνθεση. Το προϊόν προσδιορισμού αλληλουχίας ξεπλένεται.

Διαβασμένο ευρετήριο 2

• Το 3' άκρο του συμπλέγματος στη συνέχεια αποπροστατεύεται, επιτρέποντας τον υβριδισμό του άκρου 3' με τον δεύτερο τύπο ολίγο στο κελί ροής (πράσινο χρώμα). Με αυτό, λαμβάνεται η αλληλουχία της περιοχής του δείκτη 2. Το προϊόν προσδιορισμού αλληλουχίας ξεπλένεται.

Δεύτερη ανάγνωση της αλληλουχίας προώθησης

• Ο δεύτερος τύπος ολίγο επεκτείνεται από μια πολυμεράση, σχηματίζοντας μια δίκλωνη γέφυρα. Η γέφυρα μετουσιώνεται και τα 3′ άκρα τους είναι φραγμένα. Το μπροστινό σκέλος ξεπλένεται.
• Η δεύτερη ανάγνωση της αλληλουχίας προς τα εμπρός λαμβάνεται μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας με σύνθεση με υβριδισμό και επέκταση του δεύτερου εκκινητή αλληλουχίας.

Βήμα 4. Ανάλυση δεδομένων

• Οι δισεκατομμύρια αναγνώσεις που λαμβάνονται με αλληλουχία ομαδοποιούνται με βάση τις ακολουθίες ευρετηρίου τους.
• Στη συνέχεια, οι ακολουθίες με παρόμοιες αναγνώσεις συγκεντρώνονται.
• Οι αναγνώσεις προς τα εμπρός και προς τα πίσω συνδυάζονται για να σχηματίσουν συνεχόμενες ακολουθίες.
• Οι διφορούμενες ευθυγραμμίσεις μπορούν να επιλυθούν με ζευγαρωμένες ακολουθίες.
• Οι συνεχόμενες αλληλουχίες ευθυγραμμίζονται με το γονιδίωμα αναφοράς για αναγνώριση παραλλαγής.

Το παρακάτω βίντεο εξηγεί την πλήρη διαδικασία της αλληλουχίας Illumina.

Συμπέρασμα

Η αλληλουχία Illumina είναι μια μέθοδος αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Η αλληλουχία Illumina εμπλέκεται στην προετοιμασία μιας βιβλιοθήκης προσδιορισμού αλληλουχίας με 200-600 ζεύγη βάσεων μακριά θραύσματα DNA. Τα τέσσερα βήματα που εμπλέκονται στην αλληλουχία του Illumina είναι η προετοιμασία της βιβλιοθήκης, η δημιουργία συστάδων, η αλληλουχία και η ανάλυση δεδομένων. Δεδομένου ότι η αλληλουχία Illumina παρέχει αναγνώσεις ακολουθίας με υψηλή ακρίβεια, είναι η ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος αλληλουχίας στον κόσμο.

Αναφορά:

1. "Sequencing by Synthesis (SBS) Technology." Τεχνολογία αλληλουχίας | Sequencing by Synthesis , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. «Προετοιμασία επεξεργασίας DNA» από DMlapato – Δική εργασία (CC BY-SA 4.0) μέσω Commons Wikimedia
2. «Ολιγονουκλεοτιδικές αλυσίδες στο κύτταρο ροής» Από DMLapato – Δική εργασία, (CC BY-SA 4.0) μέσω Commons Wikimedia
3. «Αλληλουχία μέσω σύνθεσης Αναστρέψιμοι τερματιστές» Του Abizar Lakdawalla (συζήτηση) – Δημιούργησα αυτό το έργο εξ ολοκλήρου μόνος μου (CC BY-SA 3.0) μέσω του Commons Wikimedia
4. «Cluster Generation» Από DMLapato – Δικό έργο (CC BY-SA 4.0) μέσω Commons Wikimedia