Πώς να φτιάξετε σταθερή μεταμολυνθείσα κυτταρική γραμμή

Η σταθερή επιμόλυνση είναι η μακροπρόθεσμη εισαγωγή ξένου DNA στα κύτταρα. Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα περνούν το ξένο DNA μέσω των απογόνων. Επομένως, για να δημιουργηθούν σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές, ξένο DNA πρέπει να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα της κυτταρικής γραμμής. Ωστόσο, σταθερή κληρονομικότητα μπορεί να παρατηρηθεί και στο μη γονιδιωματικό DNA. Μια επιτυχημένη, σταθερή επιμόλυνση απαιτεί αποτελεσματικές μεθόδους παροχής DNA καθώς και μεθόδους επιλογής για ξένο DNA εντός της κυτταρικής σειράς. Οι σταθερά διαμολυνθείσες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιούνται για ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών όπως η παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, μελέτες γονιδιακής λειτουργίας, δοκιμές ανακάλυψης φαρμάκων κ.λπ.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Πώς να φτιάξετε σταθερή μεταμολυνθείσα κυτταρική γραμμή
      – Πρωτόκολλο δημιουργίας σταθερής κυτταρικής γραμμής
2. Πώς να επιλέξετε το επιμολυσμένο DNA σε κυτταρική γραμμή
     – Επιλογή σταθερά-μεταμολυμένης κυτταρικής γραμμής

Βασικοί όροι:Επισωμική Συντήρηση, Ενσωμάτωση στο Γονιδίωμα, Πλασμίδιο, Επιλογή, Σταθερά Μολυσμένες Κυτταρικές Σειρές

Πώς να κάνετε Stable Transfected Cell Line

Η διαμόλυνση είναι μια μέθοδος μεταφοράς γονιδίων κατά την οποία το γενετικό υλικό εισάγεται σκόπιμα στο κύτταρο ξενιστή με χημικές ή μη χημικές μεθόδους. Υπάρχουν δύο τύποι σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών:

1. Ο κύριος τύπος σταθερών κυτταρικών σειρών δημιουργείται από την άμεση ενσωμάτωση του επιμολυσμένου DNA στο γονιδίωμα του οργανισμού ξενιστή. Το επιμολυσμένο DNA ενσωματώνεται στο γονιδίωμα με ομόλογο ανασυνδυασμό.
2. Η άλλη μέθοδος για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών είναι η επισωματική συντήρηση του διαμολυνθέντος DNA. Οι ευκαρυωτικοί φορείς χρησιμοποιούνται στη διαμόλυνση του DNA που δεν είναι ενσωματωμένοι στο γονιδίωμα. Ωστόσο, η σταθερότητα του επισωματικού DNA είναι χαμηλή. Επίσης, τα επισώματα διατηρούνται μόνο από ορισμένους τύπους ειδών. Σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές φαίνονται στην εικόνα 1 .

Εικόνα 1:Σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές γραμμές

Διαδικασία

Τα βήματα που εμπλέκονται στη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών περιγράφονται παρακάτω.

1. Δημιουργία μιας καμπύλης θανάτωσης που καθορίζει τη βέλτιστη συγκέντρωση αντιβιοτικού επιλογής – Τα κύτταρα υποβάλλονται σε αυξανόμενες ποσότητες συγκέντρωσης αντιβιοτικού για να προσδιοριστεί η ελάχιστη συγκέντρωση αντιβιοτικού που απαιτείται για τη θανάτωση όλων των κυττάρων σε διάστημα μιας εβδομάδας.
2. Μεταμόλυνση κυττάρων με το επιθυμητό πλασμιδικό κατασκεύασμα – Η μέθοδος επιμόλυνσης διαφέρει ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων-ξενιστών. Τα αντιδραστήρια λιποσωμάτων χρησιμοποιούνται στη διαμόλυνση προσκολλημένων κυτταρικών σειρών. Ηλεκτρομετατροπή ή μέθοδοι ιού χρησιμοποιούνται για τη διαμόλυνση αιωρούμενων κυτταρικών σειρών.
3. Επιλέξτε και επεκτείνετε σταθερές πολυκλωνικές αποικίες – Σε 48-72 ώρες επιμόλυνσης, προστίθενται υψηλές, βέλτιστες και χαμηλές συγκεντρώσεις εκλεκτικών αντιβιοτικών στις καλλιέργειες για να ληφθεί το σταθερά επιμολυνθέν κύτταρο γραμμές.

Πώς να επιλέξετε Transfected DNA in Cell Line

Οι δείκτες επιλογής συνεκφράζονται με το διαμολυνθέν DNA για την επιλογή των επιτυχώς επιμολυσμένων κυττάρων. Το γονίδιο δείκτης θα μπορούσε να βρίσκεται στον ίδιο φορέα (cis) που χρησιμοποιείται για τη διαμόλυνση του κυττάρου ξενιστή ή σε έναν άλλο φορέα (trans). Στην επιλογή μπορεί να χρησιμοποιηθεί η αντοχή σε αντιβιοτικά όπως η νεομυκίνη, η ζεοκίνη, η υγρομυκίνη, η πουρομυκίνη, η DHFR κ.λπ. Επιπλέον, τα μορφομετατραπέντα γονίδια μπορούν να επισημανθούν με GFP.

Συμπέρασμα

Σταθερές κυτταρικές σειρές μπορούν να δημιουργηθούν κυρίως με την ενσωμάτωση του επιμολυσμένου DNA στο γονιδίωμα. Επιπλέον, η επισωμική διατήρηση του διαμολυνθέντος DNA μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών για μεγάλο χρονικό διάστημα σε ορισμένους οργανισμούς-ξενιστές. Θα πρέπει να υπάρχει μια μέθοδος επιλογής για την ταυτοποίηση του επιμολυσμένου DNA στην κυτταρική σειρά.

Αναφορά:

1. «Πρωτόκολλο σταθερής δημιουργίας κυτταρικής γραμμής». Δημιουργικό BioMart , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "Knockout mouse production 2" Από τον Kjaergaard – Δικό έργο (CC BY 3.0) μέσω Commons Wikimedia