Πώς να διπλώσετε ένα γραμμικό χρωμόσωμα του Streptomyces

Τα γραμμικά χρωμοσώματα βρίσκονται μόνο σε ορισμένα ακτινομυκήτες. Streptomyces is a Gram-positive bacterium with a high GC-content. Έχει ένα γραμμικό χρωμόσωμα που κυμαίνεται από 6 έως 10Mb σε μέγεθος και αρκετά κυκλικά πλασμίδια με συνολικό μέγεθος 1-10% του χρωμοσωμικού ϋΝΑ. Οι στρεπτομυκητέτες παρουσιάζουν έναν πολύπλοκο κύκλο ζωής που περιλαμβάνει ασεξουαλικές και σεξουαλικές φάσεις ανάπτυξης και είναι γνωστή για την εκτεταμένη παραγωγή χημικά διαφορετικών βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών.

Είναι απαραίτητο να γραμμικοποιηθεί το χρωμόσωμα για να επιλυθούν μεμονωμένα αντίγραφα στο πήκτωμα του παλμικού πεδίου. Τα αντίγραφα διαχωρίζονται από σεφ με βάση το μέγεθος. Συνήθως εκτελείται για μεγάλο χρονικό διάστημα, συχνά 20-30 ώρες, για να πάρει καλή λύση.

Εδώ είναι τα βήματα για το πώς να διπλώσετε ένα γραμμικό χρωμόσωμα του Streptomyces:

1. Προετοιμάστε το πήκτωμα αγαρόζης. Κάντε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1% σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,5x TBE.

2. Τοποθετήστε το δείγμα DNA. Ανακατέψτε το δείγμα DNA με ρυθμιστικό φόρτωσης 6x και φορτώστε το πάνω στο πήκτωμα αγαρόζης.

3. Εκτελέστε το πήκτωμα. Εκτελέστε το πήκτωμα στους 14 ° C για 20-30 ώρες σε 2 V/cm.

4. Οπτικοποιήστε το DNA. Βάση του πηκτώματος με βρωμιούχο αιθίδιο και απεικονίστε το DNA κάτω από το υπεριώδες φως.

5. Διπλώστε το χρωμόσωμα. Το γραμμικό χρωμόσωμα του Streptomyces θα εμφανιστεί ως μία μόνο μεγάλη ζώνη στο πήκτωμα. Για να διπλώσετε το χρωμόσωμα, κόψτε τη ζώνη έξω από το πήκτωμα και τοποθετήστε το σε ένα κομμάτι παραφιλμ.

6. Διπλώστε το παραφιλικό πάνω από το χρωμόσωμα αρκετές φορές μέχρι να διπλωθεί σε ένα συμπαγές μέγεθος.

7. Αποθηκεύστε το χρωμόσωμα. Το διπλωμένο χρωμόσωμα μπορεί να αποθηκευτεί στους -20 ° C ή -80 ° C.

Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι έχετε φορέσει γάντια και προστασία των ματιών όταν εργάζεστε με βρωμιούχο Ethidium. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μεταλλαξιογόνο και καρκινογόνο.