Πώς μπορεί να ανιχνευθεί συγκεκριμένη πρωτεΐνη σε κηλίδωση Western;
1. Εκχύλιση και προετοιμασία πρωτεΐνης:
- Το πρώτο βήμα είναι η εξαγωγή πρωτεϊνών από το δείγμα ενδιαφέροντος. Αυτό μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους, όπως η λύση των κυττάρων ή η ομογενοποίηση των ιστών, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων.
- Οι εκχυλισμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται, συνήθως χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία Bradford ή παρόμοιες μεθόδους, για να εξασφαλιστεί ίση φόρτωση πρωτεϊνών σε επακόλουθα βήματα.
2. Διαχωρισμός πρωτεϊνών:
- Το δείγμα πρωτεΐνης αναμιγνύεται με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης που περιέχει αναγωγικό παράγοντα (π.χ. βήτα-μερκαπτοαιθανόλη ή DTT) και βαφή παρακολούθησης (π.χ., μπλε βρωμοφαινόλης).
- Το μίγμα πρωτεΐνης φορτώνεται σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για ηλεκτροφόρηση. Το πήκτωμα υποβάλλεται σε ηλεκτρικό ρεύμα, προκαλώντας τη διαχωρισμό των πρωτεϊνών με βάση το μέγεθός τους. Οι μικρότερες πρωτεΐνες μεταναστεύουν ταχύτερα μέσω του πηκτώματος, ενώ οι μεγαλύτερες πρωτεΐνες κινούνται πιο αργά.
3. Μεταφορά πρωτεΐνης:
- Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρονται από το πήκτωμα σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή μεμβράνη πολυβινυλιδενίου (PVDF). Αυτή η διαδικασία, γνωστή ως κηλίδωση πρωτεΐνης ή ηλεκτρο -blotting, περιλαμβάνει την τοποθέτηση του πηκτώματος και της μεμβράνης σε ένα ρυθμιστικό μεταφοράς και την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος.
- Ως αποτέλεσμα, οι πρωτεΐνες μεταφέρονται από το πήκτωμα πάνω στη μεμβράνη, δημιουργώντας ένα αντίγραφο των διαχωρισμένων πρωτεϊνών.
4. Μπλοκάρισμα μεμβράνης:
-Για να μειωθεί η μη ειδική δέσμευση των αντισωμάτων, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF εμποδίζεται με ένα διάλυμα που περιέχει πρωτεΐνη όπως η αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) ή το μη λιπαρό ξηρό γάλα.
- Αυτό το βήμα αποκλεισμού βοηθά στην ελαχιστοποίηση των σημάτων φόντου και βελτιώνει την εξειδίκευση της δέσμευσης αντισώματος κατά τη διάρκεια των επόμενων βημάτων.
5. Πρωτογενής επώαση αντισωμάτων:
- Η μεμβράνη επωάζεται με πρωτογενές αντίσωμα που αναγνωρίζει ειδικά και δεσμεύεται με την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος. Τα πρωτογενή αντισώματα παράγονται τυπικά έναντι της πρωτεΐνης -στόχου ή ενός συγκεκριμένου επίτοπου εντός της πρωτεΐνης.
- Αυτά τα αντισώματα αραιώνονται σε ένα κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα και επωάζονται με τη μεμβράνη, επιτρέποντάς τους να δεσμεύουν τις πρωτεΐνες στόχου τους.
6. Πλύσιμο:
- Μετά την επώαση πρωτεύοντος αντισώματος, η μεμβράνη πλύνεται διεξοδικά για να απομακρυνθεί τα μη δεσμευμένα αντισώματα και να μειώσει τα σήματα φόντου. Αυτό το βήμα πλύσης είναι ζωτικής σημασίας για την εξασφάλιση ειδικής ανίχνευσης της πρωτεΐνης -στόχου.
7. Δευτερεύουσα επώαση αντισωμάτων (συζευγμένη με ένζυμο αναφοράς):
- ένα δευτερογενές αντίσωμα, συζευγμένο με ένα ένζυμο όπως η υπεροξειδάση αγροτεδάματος (HRP) ή η αλκαλική φωσφατάση (ALP), χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των συμπλεγμάτων πρωτεύοντος αντισώματος-αντιγόνου στη μεμβράνη.
- Τα δευτερογενή αντισώματα είναι ειδικά για είδη, που σημαίνει ότι αναγνωρίζουν και δεσμεύονται με τα πρωτογενή αντισώματα που παράγονται σε ένα συγκεκριμένο είδος (π.χ. ποντίκι ή κουνέλι).
- Το δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με ένζυμο συνδέεται με το πρωτογενές αντίσωμα, δημιουργώντας ένα σύμπλεγμα που επιτρέπει την ενίσχυση του σήματος και την απεικόνιση.
8. Πλύσιμο:
- Ένα άλλο βήμα πλύσης εκτελείται για την απομάκρυνση των μη δεσμευμένων δευτερογενών αντισωμάτων και τη μείωση των σημάτων υποβάθρου.
9. Ανίχνευση χημειοφωταύγειας:
- Για δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με HRP, προστίθεται στη μεμβράνη ένα υπόστρωμα χημειοφωταύγειας. Όταν το υπόστρωμα αντιδρά με HRP, εκπέμπει φως.
- Εξειδικευμένα συστήματα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ή μεμβράνες ακτίνων Χ χρησιμοποιούνται για τη σύλληψη και απεικόνιση των εκπεμπόμενων σημάτων φωτός. Η ένταση του φωτός αντιστοιχεί στην ποσότητα της πρωτεΐνης -στόχου που υπάρχει στο δείγμα.
10. Ανάλυση και ερμηνεία δεδομένων:
- Οι αναπτυγμένες εικόνες ακτίνων Χ ή ψηφιακής χημειοφωταύγειας αναλύονται για να εντοπιστούν ζώνες ή κηλίδες που αντιστοιχούν στην πρωτεΐνη στόχου.
- Το μέγεθος και η ένταση αυτών των ζωνών μπορούν να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με το μοριακό βάρος, την αφθονία και τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της ανιχνευόμενης πρωτεΐνης.
Ακολουθώντας αυτά τα βήματα, η κηλίδωση Western επιτρέπει την ειδική ανίχνευση και ανάλυση μιας πρωτεΐνης ενδιαφέροντος σε ένα σύνθετο μίγμα πρωτεϊνών. Χρησιμοποιείται ευρέως σε διάφορους τομείς βιολογικής έρευνας, συμπεριλαμβανομένης της μοριακής βιολογίας, της ανοσολογίας και της κλινικής διάγνωσης.
