Πώς γίνεται ένα ανθρώπινο ινσουλίνη γονίδια μέρος του πλασμιδίου;
1. Απομόνωση του ανθρώπινου γονιδίου ινσουλίνης
* Εκχύλιση mRNA: Η ανθρώπινη ινσουλίνη mRNA εκχυλίζεται από κύτταρα που παράγουν ινσουλίνη (βήτα κύτταρα στο πάγκρεας).
* Αντίστροφη μεταγραφή: Το mRNA μετατρέπεται σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση. Αυτό το cDNA είναι ένα σταθερό αντίγραφο του γονιδίου ινσουλίνης.
2. Τροποποίηση του γονιδίου (προαιρετικό)
* Βελτιστοποίηση για βακτηριακή έκφραση: Το γονίδιο ινσουλίνης μπορεί να χρειαστεί ελαφρές τροποποιήσεις για να εξασφαλιστεί ότι εκφράζεται βέλτιστα από βακτήρια. Αυτό μπορεί να περιλαμβάνει:
* Αλλαγή κωδικόνων: Ο γενετικός κώδικας μπορεί να τροποποιηθεί ελαφρώς για να ταιριάζει με τα προτιμώμενα κωδικόνια που χρησιμοποιούνται από τα βακτήρια.
* Προσθήκη θέσεων ενζύμου περιορισμού: Αυτό επιτρέπει την ακριβή εισαγωγή στο πλασμίδιο.
3. Προετοιμασία του πλασμιδίου
* Επιλογή του πλασμιδίου: Έχει επιλεγεί κατάλληλο διάνυσμα πλασμιδίου. Αυτά είναι μικρά, κυκλικά μόρια DNA που μπορούν να αναπαράγουν ανεξάρτητα μέσα στα βακτήρια. Έχουν συνήθως:
* Προέλευση της αναπαραγωγής: Αυτή η ακολουθία επιτρέπει στο πλασμίδιο να αναπαραχθεί μέσα στο βακτηριακό κύτταρο.
* γονίδιο αντίστασης αντιβιοτικών: Αυτό το γονίδιο επιτρέπει την επιλογή βακτηρίων που φέρουν το πλασμίδιο.
* Ιστοσελίδα πολλαπλής κλωνοποίησης (MCS): Αυτή η περιοχή περιέχει μια ποικιλία θέσεων αναγνώρισης ενζύμων περιορισμού, επιτρέποντας την εύκολη εισαγωγή του γονιδίου ινσουλίνης.
4. Κοπή του πλασμιδίου και εισαγωγή του γονιδίου
* Ένζυμα περιορισμού: Το πλασμίδιο και το γονίδιο ινσουλίνης κόβονται χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού, τα οποία αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες ϋΝΑ. Αυτό δημιουργεί τα "κολλώδη άκρα" και στα δύο μόρια DNA.
* σύνδεση: Το κομμένο πλασμίδιο και το τροποποιημένο γονίδιο ινσουλίνης αναμειγνύονται μαζί με τη λιγάση ϋΝΑ. Αυτό το ένζυμο ενώνει τα κολλώδη άκρα, εισάγοντας αποτελεσματικά το γονίδιο ινσουλίνης στο πλασμίδιο.
5. Μετασχηματισμός βακτηρίων
* αρμόδια κύτταρα: Τα βακτήρια γίνονται "ικανά" για να αναλάβουν το DNA. Αυτό μπορεί να περιλαμβάνει τη θεραπεία τους με χλωριούχο ασβέστιο ή άλλες μεθόδους.
* Μετασχηματισμός: Το πλασμίδιο που περιέχει το γονίδιο ινσουλίνης εισάγεται στα αρμόδια βακτηριακά κύτταρα.
* Επιλογή: Τα βακτήρια που έχουν πάρει με επιτυχία το πλασμίδιο επιλέγονται με την επένδυση σε ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει το αντιβιοτικό που το πλασμίδιο προσδίδει αντίσταση. Μόνο εκείνα τα βακτήρια που έχουν το πλασμίδιο μπορούν να επιβιώσουν.
6. Έκφραση ινσουλίνης
* Παραγωγή: Τα μετασχηματισμένα βακτήρια φέρουν τώρα το ανθρώπινο γονίδιο ινσουλίνης και εκφράζουν το, παράγοντας πρωτεΐνη ανθρώπινης ινσουλίνης.
* Καθαρισμός: Η πρωτεΐνη ινσουλίνης εκχυλίζεται και καθαρίζεται από τα βακτηριακά κύτταρα.
Συνοπτικά:
Αυτή η διαδικασία επιτρέπει την παραγωγή μεγάλης κλίμακας ανθρώπινης ινσουλίνης, μια ζωτική θεραπεία για τον διαβήτη. Συνδυάζοντας τη δύναμη της γενετικής μηχανικής, των συστημάτων βακτηριακής έκφρασης και των αυστηρών μεθόδων καθαρισμού, οι επιστήμονες μπορούν να παράγουν ασφαλή και αποτελεσματική ινσουλίνη για εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως.
