Πώς θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί η ηλεκτροφόρηση Gel για να πει εάν ένα πείραμα γενετικής τροποποίησης ήταν επιτυχής;
1. Επιβεβαίωση της ενσωμάτωσης εισαγωγής:
* Περίληψη και ανάλυση ενζύμου περιορισμού: Εάν η γενετική τροποποίηση περιλαμβάνει την εισαγωγή ενός συγκεκριμένου γονιδίου, το DNA από τον τροποποιημένο οργανισμό μπορεί να αφομοιωθεί με ένζυμα περιορισμού που κόβονται σε συγκεκριμένες θέσεις εντός του εισαγόμενου γονιδίου. Τα θραύσματα που προκύπτουν μπορούν στη συνέχεια να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Η παρουσία των αναμενόμενων μεγεθών θραυσμάτων επιβεβαιώνει την ενσωμάτωση του γονιδίου.
* Ενίσχυση και ανάλυση PCR: Ειδικοί εκκινητές μπορούν να σχεδιαστούν για να ενισχύσουν την αλληλουχία γονιδίων που εισάγονται. Η παρουσία του ενισχυμένου προϊόντος υποδεικνύει την επιτυχή ενσωμάτωση του γονιδίου.
2. Επαλήθευση της έκφρασης:
* απομόνωση και ανάλυση RNA: Το RNA που εξάγεται από τον τροποποιημένο οργανισμό μπορεί να αναλυθεί με ηλεκτροφόρηση πηκτής για να ανιχνεύσει την παρουσία mRNA που αντιστοιχεί στο εισαγόμενο γονίδιο. Αυτό επιβεβαιώνει ότι το γονίδιο μεταγράφεται.
* Ανάλυση στυπώματος Western: Αυτή η τεχνική μπορεί να ανιχνεύσει την παρουσία του πρωτεϊνικού προϊόντος του εισαγόμενου γονιδίου.
Παράδειγμα:
Φανταστείτε ότι έχετε τροποποιήσει γενετικά ένα φυτό για να εκφράσετε ένα γονίδιο για την αντίσταση στα ζιζανιοκτόνα.
* Βήμα 1: Θα απομονώσετε το DNA τόσο από τα τροποποιημένα όσο και από τα μη τροποποιημένα φυτά.
* Βήμα 2: Θα χρησιμοποιούσατε τα ένζυμα περιορισμού για να κόψετε το DNA, ειδικά στοχεύοντας στην περιοχή όπου εισήχθη το γονίδιο αντίστασης σε ζιζανιοκτόνα.
* Βήμα 3: Θα τρέξετε το Dance DNA σε συσκευή ηλεκτροφόρησης πηκτής.
* Βήμα 4: Θα αναζητούσατε μια συγκεκριμένη ζώνη στο πήκτωμα που αντιστοιχεί στο μέγεθος του εισαγόμενου γονιδίου. Εάν η ζώνη υπάρχει στο τροποποιημένο εργοστάσιο αλλά απουσιάζει στο μη τροποποιημένο εργοστάσιο, επιβεβαιώνει την επιτυχή ενσωμάτωση του γονιδίου.
Περιορισμοί:
* Η ηλεκτροφόρηση πηκτής δεν είναι πάντα η πιο ευαίσθητη τεχνική. Μπορεί να μην ανιχνεύει μικρές αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση ή μικρές ποσότητες εισαγόμενου DNA.
* Μπορεί να είναι δύσκολο να γίνει διάκριση μεταξύ διαφορετικών τύπων μεταλλάξεων ή εισαγωγών γονιδίων χρησιμοποιώντας μόνο ηλεκτροφόρηση πηκτής.
* Ενώ η ηλεκτροφόρηση πηκτής μπορεί να επιβεβαιώσει την παρουσία του επιθυμητού γονιδίου, δεν μπορεί να επιβεβαιώσει τη λειτουργικότητά του. Απαιτούνται περαιτέρω λειτουργικές μελέτες για να επιβεβαιωθεί ότι το γονίδιο εκφράζεται και λειτουργεί σωστά.
Άλλες τεχνικές:
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής χρησιμοποιείται συχνά σε συνδυασμό με άλλες τεχνικές όπως η αλληλουχία, η κηλίδωση Southern και το qPCR για να παρέχουν μια πιο ολοκληρωμένη αξιολόγηση του πειράματος γενετικής τροποποίησης.
Συμπερασματικά, η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την ανάλυση του DNA και του RNA και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εκτιμηθεί η επιτυχία ενός πειράματος γενετικής τροποποίησης. Ωστόσο, είναι σημαντικό να χρησιμοποιηθούν άλλες μεθόδους και τεχνικές για να επιβεβαιώσουν τα αποτελέσματα και να αξιολογηθούν πλήρως η επιτυχία του πειράματος.
