Ποιες είναι οι σωστές ακολουθίες συμβάντων στην παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA;
1. Απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος:
* Πηγή: Το επιθυμητό γονίδιο λαμβάνεται από τον αρχικό του οργανισμό (π.χ. βακτήρια, φυτό, ζώο).
* Μέθοδοι: Αυτό μπορεί να περιλαμβάνει:
* Περιορισμός ενζύμου πέψη: Ειδικά ένζυμα κόβουν το DNA σε ακριβείς αλληλουχίες.
* PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης): Ενισχύει ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA.
2. Προετοιμασία του φορέα:
* Επιλογή φορέα: Έχει επιλεγεί ένας κατάλληλος φορέας (π.χ. πλασμίδιο, ιός). Ο φορέας πρέπει να είναι σε θέση να αναπαραχθεί στο κελί ξενιστή.
* Περιορισμός ενζύμου πέψη: Ο φορέας κόβεται με το ίδιο ένζυμο περιορισμού που χρησιμοποιείται για το γονίδιο ενδιαφέροντος, δημιουργώντας συμβατά άκρα.
* σύνδεση: Το γονίδιο ενδιαφέροντος και ο ανοιχτός φορέας συνδυάζονται χρησιμοποιώντας λιγάση ϋΝΑ, η οποία σφραγίζει το DNA πίσω μαζί.
3. Μετασχηματισμός:
* Εισαγωγή στο κελί ξενιστή: Το ανασυνδυασμένο ϋΝΑ εισάγεται σε ένα κύτταρο ξενιστή (π.χ. βακτήρια, ζύμη).
* Μέθοδοι: Οι συνήθεις μέθοδοι περιλαμβάνουν:
* Χημικός μετασχηματισμός: Τα κύτταρα αντιμετωπίζονται με χημικά που αυξάνουν τη διαπερατότητα στο DNA.
* Ηλεκτροδιάκριση: Ένας σύντομος ηλεκτρικός παλμός δημιουργεί προσωρινούς πόρους στην κυτταρική μεμβράνη.
4. Επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων:
* γονίδια δείκτη: Ο φορέας μεταφέρει συχνά γονίδια δείκτη (π.χ. αντίσταση στα αντιβιοτικά) που επιτρέπουν την ταυτοποίηση κυττάρων που περιέχουν το ανασυνδυασμένο DNA.
* Ανάπτυξη σε επιλεκτικά μέσα: Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε μέσα που περιέχουν το αντιβιοτικό. Μόνο τα κύτταρα με το γονίδιο δείκτη θα επιβιώσουν και θα πολλαπλασιαστούν.
5. Παραγωγή του γονιδιακού προϊόντος:
* Έκφραση: Τα μετασχηματισμένα κύτταρα καλλιεργούνται σε μεγάλες ποσότητες και εκφράζεται το γονίδιο ενδιαφέροντος.
* Παραγωγή πρωτεΐνης: Το DNA του γονιδίου μεταγράφεται σε mRNA, το οποίο στη συνέχεια μεταφράζεται στην επιθυμητή πρωτεΐνη.
* Καθαρισμός (προαιρετικό): Εάν η πρωτεΐνη είναι το επιθυμητό προϊόν, μπορεί να καθαριστεί για να απομακρυνθούν άλλα κυτταρικά συστατικά.
Βασικά σημεία που πρέπει να θυμάστε:
* Ένζυμα περιορισμού: Αυτά δρουν σαν μοριακό ψαλίδι, κοπτικό DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες, αφήνοντας "κολλώδη άκρα" που μπορούν να βασικά ζεύγη με συμβατά άκρα σε άλλα θραύσματα DNA.
* φορείς: Αυτά είναι οχήματα που φέρουν το γονίδιο ενδιαφέροντος στο κελί ξενιστή. Τα πλασμίδια είναι κυκλικά κομμάτια DNA που αναπαράγονται ανεξάρτητα στα βακτήρια. Οι ιικοί φορείς μπορούν να ενσωματώσουν το γονίδιο στο γονιδίωμα του ξενιστή.
* γονίδια δείκτη: Αυτά τα γονίδια επιτρέπουν την επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων.
* Αποδοτικότητα μετασχηματισμού: Η διαδικασία εισαγωγής ξένου DNA σε κύτταρα δεν είναι 100% αποτελεσματική. Δεν θα αναλάβουν με επιτυχία όλα τα κύτταρα το ανασυνδυασμένο DNA.
Επιτρέψτε μου να ξέρω αν θέλετε περισσότερες λεπτομέρειες σε οποιαδήποτε συγκεκριμένη πτυχή αυτής της διαδικασίας!
