Ποια πρώτα βήματα έκαναν οι επιστήμονες για την παραγωγή διαγονιδιακών βακτηρίων που έκαναν ινσουλίνη;
1. Απομόνωση του ανθρώπινου γονιδίου ινσουλίνης:
* Προσδιορισμός του γονιδίου: Οι ερευνητές έπρεπε πρώτα να εντοπίσουν την ακριβή ακολουθία DNA που κωδικοποιεί την ανθρώπινη ινσουλίνη. Αυτό περιλάμβανε τη μελέτη του ανθρώπινου γονιδιώματος και την κατανόηση της δομής της πρωτεΐνης ινσουλίνης.
* κλωνοποίηση του γονιδίου: Μόλις εντοπιστεί το γονίδιο, χρησιμοποίησαν τεχνικές όπως ένζυμα περιορισμού και πλασμίδια για να κόψουν το γονίδιο ινσουλίνης από το ανθρώπινο DNA και να το εισάγουν σε ένα μικρό, κυκλικό κομμάτι DNA που ονομάζεται πλασμίδιο. Αυτό δημιούργησε ένα ανασυνδυασμένο μόριο DNA.
2. Επιλέγοντας έναν κατάλληλο βακτηριακό κεντρικό υπολογιστή:
* e. Coli ως Workhorse: Το βακτήριο * Escherichia coli * (Ε. Coli) επιλέχθηκε ως οργανισμός υποδοχής. Είναι ένα καλά μελετημένο, εύκολα χειρισμένο και γρήγορα αναπαραγωγικό βακτήριο, καθιστώντας το ιδανικό για παραγωγή μεγάλης κλίμακας.
3. Εισαγωγή του γονιδίου σε βακτήρια:
* Μετασχηματισμός: Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο που περιείχε το ανθρώπινο γονίδιο ινσουλίνης εισήχθη σε κύτταρα Ε. Coli. Αυτή η διαδικασία, που ονομάζεται μετασχηματισμός, περιλάμβανε τη δημιουργία συνθηκών όπου τα βακτήρια θα αναλάβουν το πλασμίδιο.
4. Επιλέγοντας για διαγονιδιακά βακτήρια:
* Αντοχή στα αντιβιοτικά: Το πλασμίδιο περιείχε συχνά ένα γονίδιο για την αντίσταση στα αντιβιοτικά. Αυτό επέτρεψε στους ερευνητές να εντοπίσουν εύκολα τα βακτήρια που είχαν πάρει με επιτυχία το πλασμίδιο. Θα καλλιεργούσαν τα βακτήρια παρουσία του αντιβιοτικού και μόνο αυτά τα βακτήρια με το πλασμίδιο θα επιβιώσουν.
5. Εκφράζοντας το γονίδιο ινσουλίνης:
* Προαγωγοί και ρύθμιση: Το πλασμίδιο σχεδιάστηκε έτσι ώστε να εκφράζεται το ανθρώπινο γονίδιο ινσουλίνης (ενεργοποιημένο) μέσα στο Ε. Coli. Αυτό περιλάμβανε μια αλληλουχία προαγωγού - μια περιοχή DNA που αναφέρει στους βακτηριακούς μηχανές να αρχίσουν να διαβάζουν και να μεταγράφουν το γονίδιο ινσουλίνης.
6. Παραγωγή και καθαρισμός ινσουλίνης:
* ζύμωση μεγάλης κλίμακας: Τα διαγονιδιακά βακτήρια Ε. Coli αναπτύχθηκαν σε μεγάλες δεξαμενές ζύμωσης, επιτρέποντάς τους να παράγουν μεγάλες ποσότητες ινσουλίνης.
* Καθαρισμός: Μετά τη ζύμωση, η ινσουλίνη που παράγεται από τα βακτήρια έπρεπε να καθαριστεί από τα υπόλοιπα βακτηριακά συστατικά. Αυτό περιελάμβανε διάφορες τεχνικές όπως η χρωματογραφία και η διήθηση.
Σημαντική σημείωση: Αυτή είναι μια απλοποιημένη επισκόπηση. Η διαδικασία περιελάμβανε πολλές τεχνικές λεπτομέρειες, επαναλήψεις και προκλήσεις και πολλοί λαμπροί επιστήμονες συνέβαλαν στην επιτυχία της.
