Απομόνωση του γονιδιωματικού DNA από φύλλα αραχιδέλης;

Απομόνωση του γονιδιωματικού DNA από φύλλα αραχιδομών:ένας οδηγός βήμα προς βήμα

Αυτό το πρωτόκολλο περιγράφει μια βασική μέθοδο για την εξαγωγή γονιδιωματικού DNA από φύλλα αραχιδέλης χρησιμοποιώντας μια απλή και οικονομικά αποδοτική προσέγγιση.

Υλικά:

* Φύλλα αραχίδων (φρέσκα ή κατεψυγμένα)

* Υγρό άζωτο

* Κονίαμα και γουδοχέρι

* 1,5 ml σωλήνες μικροεπεξεργασίας

* 100 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0)

* 25 mM EDTA (ρΗ 8.0)

* 1,4 m NaCl

* 10% SDS (δωδεκυλοθειικό νάτριο)

* Χλωροφόρμιο:ισοαμυλική αλκοόλη (24:1)

* Ισοπροπανόλη

* 70% αιθανόλη

* RNase A διάλυμα (10 mg/ml)

* Φασματοφωτόμετρο

Διαδικασία:

1. Προετοιμασία δείγματος:

* Συλλέξτε φρέσκα ή κατεψυγμένα φύλλα αραχίδων. Εάν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα φύλλα, ξεπαγώστε τα σε θερμοκρασία δωματίου.

* Ζυγίζει περίπου 0,1-0,2 g ιστού φύλλων.

* Τοποθετήστε τα φύλλα σε ένα προ-συνδεδεμένο κονίαμα και αλέστε τα σε μια λεπτή σκόνη χρησιμοποιώντας υγρό άζωτο.

2. λύση:

* Μεταφέρετε τα φύλλα σε σκόνη σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου 1,5 ml.

* Προσθέστε 500 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 25 mM EDTA, ρΗ 8,0, 1,4 Μ NaCl και 10% SDS).

* Επωάστε το σωλήνα στους 65 ° C για 30 λεπτά με περιστασιακή απαλή ανάκαμψη. Αυτό το βήμα σπάει τα κυτταρικά τοιχώματα και τις μεμβράνες, απελευθερώνοντας το DNA.

3. Απομάκρυνση πρωτεΐνης:

* Προσθέστε 200 μΐ χλωροφόρμιο:ισοαμυλική αλκοόλη (24:1) στον σωλήνα.

* Ανακινήστε τον σωλήνα έντονα για 10 λεπτά.

* Φυγοκεντρήστε τον σωλήνα στα 10.000 x g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό το βήμα διαχωρίζει το διάλυμα σε τρία στρώματα:υδατικό στρώμα (κορυφή), ενδιάμεση φάση (μεσαία) και οργανικό στρώμα (κάτω). Το DNA βρίσκεται στο υδατικό στρώμα.

4. Κατοικίες DNA:

* Μεταφέρετε προσεκτικά το υδατικό στρώμα σε ένα νέο σωλήνα μικροφυγοκέντρου 1,5 ml.

* Προσθέστε 0,5 όγκο ισοπροπανόλης στον σωλήνα και ανακατέψτε απαλά. Αυτό θα προκαλέσει το DNA από το διάλυμα.

* Επωάστε το σωλήνα στους -20 ° C για 30 λεπτά.

* Φυγοκεντρήστε τον σωλήνα στα 10.000 x g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το σφαιρίδιο DNA θα σχηματιστεί στο κάτω μέρος του σωλήνα.

5. Πλύσιμο και ξήρανση:

* Αφαιρέστε το υπερκείμενο και πλύνετε το σφαιρίδιο DNA με 500 μΐ 70% αιθανόλης.

* Φυγοκεντρήστε τον σωλήνα στα 10.000 x g για 5 λεπτά στους 4 ° C.

* Αφαιρέστε την αιθανόλη και στεγνώστε το σφαιρίδιο για 5-10 λεπτά.

6.

* Ελέγξτε το σφαιρίδιο DNA σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ (10 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 1 mM EDTA, ρΗ 8,0).

* Προσθέστε 1 μL διαλύματος RNase Α (10 mg/ml) στον σωλήνα.

* Επωάστε το σωλήνα στους 37 ° C για 30 λεπτά για να αφαιρέσετε οποιοδήποτε υπόλοιπο RNA.

7. Ποσοτικοποίηση DNA και έλεγχος ποιότητας:

* Ποσοτικοποίηση του εκχυλισμένου DNA χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στα 260 nm και 280 nm μήκη κύματος. Ο λόγος απορρόφησης στα 260 nm/280 nm πρέπει να είναι μεταξύ 1,8 και 2,0, υποδεικνύοντας καθαρό DNA.

Σημειώσεις:

* Αυτό το πρωτόκολλο είναι μια βασική κατευθυντήρια γραμμή και μπορεί να χρειαστεί να προσαρμοστεί με βάση το συγκεκριμένο υλικό των φύλλων και την επιθυμητή ποιότητα του DNA.

* Φορούν πάντα γάντια και εργαστηριακά παλτά όταν χειρίζεστε βιολογικά δείγματα.

* Βεβαιωθείτε ότι όλα τα αντιδραστήρια και ο εξοπλισμός είναι αποστειρωμένα για να αποφύγετε τη μόλυνση.

* Μπορείτε επίσης να χρησιμοποιήσετε εμπορικά κιτ εκχύλισης DNA για μια πιο εξορθολογισμένη και αποτελεσματική διαδικασία.

Περαιτέρω εφαρμογές:

* Το απομονωμένο γονιδιωματικό DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διάφορες εφαρμογές μοριακής βιολογίας, συμπεριλαμβανομένου:

* PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης)

* Προσδιορισμό αλληλουχίας DNA

* Γενετική ανάλυση

* Κλωνοποίηση

Αυτό το πρωτόκολλο παρέχει μια απλή και οικονομικά αποδοτική μέθοδο για την απομόνωση του γονιδιωματικού DNA από φύλλα αραχιδέλης, ανοίγοντας το δρόμο για διάφορες έρευνες και εφαρμογές.