Τι είναι η εσωτερική πρωτεΐνη μεμβράνης και το εξωτερικό πώς μπορείτε να πάρετε από το E. coli πώς να διαχωρίσετε την πρωτεΐνη;

πρωτεΐνες εσωτερικής μεμβράνης και πρωτεΐνες εξωτερικής μεμβράνης σε Ε. Coli

πρωτεΐνες εσωτερικής μεμβράνης (IMPS) :Αυτές οι πρωτεΐνες είναι ενσωματωμένες μέσα στην εσωτερική μεμβράνη του Ε. Coli, μια διπλοστιβάδα φωσφολιπιδίου που περικλείει το κυτταρόπλασμα. Παίζουν κρίσιμους ρόλους σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως:

* Μεταφορά: Διευκολύνοντας την κίνηση των θρεπτικών ουσιών, των ιόντων και των αποβλήτων σε όλη τη μεμβράνη.

* Μεταγωγή σήματος: Αναμετάδοση σήματα από το περιβάλλον στο εσωτερικό του κυττάρου.

* Μεταβολισμός ενέργειας: Συμμετέχοντας σε διαδικασίες όπως η μεταφορά ηλεκτρονίων και η σύνθεση ΑΤΡ.

πρωτεΐνες εξωτερικής μεμβράνης (OMPS) :Αυτές οι πρωτεΐνες βρίσκονται στην εξωτερική μεμβράνη του Ε. Coli, μια δεύτερη διπλοστιβάδα φωσφολιπιδίου που περιβάλλει την εσωτερική μεμβράνη και παρέχει δομική υποστήριξη και προστασία. Συμμετέχουν σε:

* Σχηματισμός Porin: Δημιουργία καναλιών που επιτρέπουν τη διέλευση μικρών μορίων.

* Δραστηριότητα υποδοχέα: Δέσμευση σε συγκεκριμένα μόρια και ενεργοποίηση κυτταρικών αποκρίσεων.

* προσκόλληση: Συνδέοντας σε επιφάνειες ή άλλα κύτταρα.

Διαχωρισμός πρωτεϊνών εσωτερικού και εξωτερικής μεμβράνης από Ε. Coli

Ακολουθεί μια γενική προσέγγιση για τον διαχωρισμό αυτών των τύπων πρωτεϊνών από το Ε. Coli:

1. Κυτταρική λύση:

* Μηχανική λύση: Χρησιμοποιήστε μεθόδους όπως η υπερήχηση ή ο γαλλικός τύπος για να διαταράξετε το κυτταρικό τοίχωμα και να απελευθερώσετε τα περιεχόμενα των κυττάρων.

* Χημική λύση: Χρησιμοποιήστε απορρυπαντικά όπως το Triton Χ-100 ή το SDS για να διαλύσετε τα λιπίδια μεμβράνης.

2. Διαφορική φυγοκέντρηση:

* φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας (10.000 x g): Αυτό το βήμα αφαιρεί τα κυτταρικά υπολείμματα, συμπεριλαμβανομένων των αδιάσπαστων κυττάρων και των μεγάλων κυτταρικών συστατικών.

* φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας (100.000 x g): Αυτό το βήμα διαχωρίζει τις εσωτερικές και εξωτερικές μεμβράνες από το διαλυτό κυτταρόπλασμα. Το σφαιρίδιο που περιέχει και τις δύο μεμβράνες συλλέγεται.

3. Κλασματοποίηση μεμβράνης:

* φυγοκέντρηση βαθμίδωσης σακχαρόζης: Αυτή η μέθοδος διαχωρίζει τις μεμβράνες με βάση την πυκνότητα τους. Η εξωτερική μεμβράνη είναι συνήθως λιγότερο πυκνή από την εσωτερική μεμβράνη, επιτρέποντας τον διαχωρισμό τους.

* Triton X-114 Διαχωρισμός φάσης: Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί ένα μη ιονικό απορρυπαντικό για να διαχωρίσει τις πρωτεΐνες με βάση την υδροφοβικότητα τους. Τα IMPS είναι πιο υδρόφοβα από τα OMPs, οδηγώντας στην κατανομή τους στην πλούσια σε απορρυπαντικά φάση.

4. Καθαρισμός:

* χρωματογραφία συγγένειας: Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί συγκεκριμένους συνδέτες που συνδέονται με την πρωτεΐνη στόχου, επιτρέποντας τον διαχωρισμό της από άλλες πρωτεΐνες.

* Χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων: Αυτή η μέθοδος διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση το φορτίο τους.

* Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους: Αυτή η τεχνική διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση το μέγεθός τους.

5. Επιβεβαίωση:

* SDS-PAGE: Αυτή η τεχνική ηλεκτροφόρησης διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση το μοριακό τους βάρος.

* κηλίδωση Western: Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί αντισώματα για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών.

Σημαντικές σημειώσεις:

* Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο θα εξαρτηθεί από την πρωτεΐνη -στόχο και τις ιδιότητές του.

* Η βελτιστοποίηση κάθε βήματος είναι ζωτικής σημασίας για την απόκτηση καθαρής και λειτουργικής πρωτεΐνης.

* Τεχνικές όπως η φασματομετρία μάζας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω ανάλυση των διαχωρισμένων κλασμάτων πρωτεϊνών.

Εμπορικά κιτ:

Αρκετά εμπορικά κιτ είναι διαθέσιμα για την απομόνωση πρωτεϊνών εσωτερικών και εξωτερικών μεμβρανών Ε. Coli, οι οποίες μπορούν να απλοποιήσουν τη διαδικασία.

Ακολουθώντας αυτά τα βήματα και επιλέγοντας τις κατάλληλες τεχνικές, οι ερευνητές μπορούν να διαχωριστούν με επιτυχία και να καθαρίσουν τις εσωτερικές και τις εξωτερικές μεμβράνες πρωτεΐνες από το Ε. Coli, επιτρέποντας την περαιτέρω ανάλυση της δομής, της λειτουργίας και των αλληλεπιδράσεών τους.