Μια βελτιωμένη μέθοδος για την αφαίρεση υπολειμμάτων από αιωρήματα αυγών νηματωδών κύστεων και τεχνολογίες με τη βοήθεια υπολογιστή για μέτρηση αυγών
Οι φυτοπαρασιτικοί νηματώδεις μολύνουν τις ρίζες των φυτών, προκαλώντας απώλεια καλλιεργειών δισεκατομμυρίων δολαρίων παγκοσμίως. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι ο νηματώδης κύστη σόγιας (SCN), ο οποίος είναι το πιο επιβλαβές παθογόνο της σόγιας στη Βόρεια Αμερική. Η γνώση της πυκνότητας του πληθυσμού (αριθμός) των αυγών νηματωδών στο έδαφος είναι ζωτικής σημασίας για την ανίχνευση, την παρακολούθηση και την αποτελεσματική διαχείριση του παρασίτου.
Για να προσδιοριστεί η πυκνότητα των αυγών που υπάρχει σε ένα χωράφι, συλλέγονται δείγματα εδάφους από το χωράφι και ανακτώνται κύστεις νηματωδών (νεκρό θηλυκό γεμάτο αυγά) από το έδαφος χρησιμοποιώντας υγρό κοσκίνισμα και απόχυση ή εκλούσεις. Στη συνέχεια, οι κύστεις των νηματωδών διαρρηγνύονται, απελευθερώνοντας τα αυγά που συλλαμβάνονται σε ένα κόσκινο μαζί με υπολείμματα μεγέθους αυγού. Παραδοσιακά, τα υπολείμματα αφαιρούνται από τα εναιωρήματα αυγών χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση σακχαρόζης και στη συνέχεια τα αυγά χρωματίζονται και μετρώνται οπτικά κάτω από ένα μικροσκόπιο για να εκτιμηθεί η πυκνότητα πληθυσμού των αυγών στο δείγμα εδάφους.
Το πρόβλημα είναι ότι τα περισσότερα από τα παραδοσιακά βήματα καθαρισμού και μέτρησης της εναιώρησης αυγών πραγματοποιούνται χειροκίνητα και είναι χρονοβόρα και επίπονα, περιορίζοντας έτσι τον χρόνο και την απόδοση. Ένας περιορισμένος αριθμός δειγμάτων εδάφους μπορεί να εξαχθεί και να αναλυθεί σε μια δεδομένη ημέρα. Και ενώ η σακχαρόζη είναι φθηνή, η φυγοκέντρηση της σακχαρόζης δεν αφαιρεί εντελώς τα υπολείμματα, καθιστώντας κατά καιρούς δύσκολη την καταμέτρηση των αυγών. Επίσης, τα υπολείμματα σακχαρόζης μπορούν να παραμείνουν στην επιφάνεια των αυγών μετά τη φυγοκέντρηση προάγοντας την ανάπτυξη μολυσματικών μυκήτων και βακτηρίων στα δείγματα όταν αυτά αποθηκεύονται. Χρειαζόταν καλύτερη διαδικασία καθαρισμού δειγμάτων αυγού με αυτοματοποιημένη μέτρηση αυγών.
Αναπτύξαμε ένα πρωτόκολλο καθαρισμού δείγματος αυγού χρησιμοποιώντας OptiPrepTM ως μέσο βαθμίδωσης πυκνότητας, αντί για σακχαρόζη. Για αυτό, χρησιμοποιήθηκε υγρό κοσκίνισμα και μετάγγιση για την εξαγωγή των αυγών και των υπολειμμάτων από δείγματα εδάφους. Τα αυγά στη συνέχεια χρωματίστηκαν για να βελτιωθεί η οπτικοποίηση μεταξύ των συντριμμιών. Το εναιώρημα αυγού αναμίχθηκε με OptiPrep, τοποθετήθηκε σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 15 mL και φυγοκεντρήθηκε στα 840 G για 2 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα περισσότερα αυγά νηματωδών συλλέχθηκαν στο στρώμα γαλακτώματος διεπαφής ενώ τα βαρύτερα σωματίδια υπολειμμάτων εναποτέθηκαν στον πυθμένα του σωλήνα. Προσδιορίσαμε τη σωστή συγκέντρωση του OptiPrep για να επιτύχουμε τον καλύτερο καθαρισμό δείγματος.
Για να αυτοματοποιηθεί η μέτρηση των αυγών, τα καθαρισμένα, χρωματισμένα δείγματα αυγών απλώθηκαν σε διηθητικό χαρτί και σαρώθηκαν με σαρωτή υψηλής ανάλυσης. Μια αρχιτεκτονική βαθιάς μάθησης που χρησιμοποιεί ένα συνελικτικό δίκτυο αυτόματου κωδικοποιητή έψαξε τις σαρωμένες εικόνες για να αναγνωρίσει και να μετρήσει τα αυγά νηματωδών στο δείγμα. Μια εναλλακτική μέθοδος μέτρησης αυγών νηματωδών αναπτύχθηκε με ροή του εναιωρήματος αυγού μέσω μικρορευστοποιημένου τσιπ με απεικόνιση χωρίς φακό. Καθώς τα αυγά και τα συντρίμμια περνούσαν μέσα από το τσιπ ροής, δημιουργήθηκε και αποθηκεύτηκε ένα ολογραφικό βίντεο με διερχόμενα αντικείμενα. Με την ανακατασκευή των ολογραφικών βίντεο, το λογισμικό μπόρεσε να αναγνωρίσει τα αυγά των νηματωδών (ακόμη και χωρίς χρώση) και να διατηρήσει έναν τρέχοντα αριθμό του συνολικού αριθμού αυγών στο δείγμα.
Για να ελεγχθεί η απόδοση των νέων μεθόδων καθαρισμού και απεικόνισης δειγμάτων, συλλέχθηκαν δείγματα εδάφους από δύο χωράφια σε ερευνητικές φάρμες του Iowa State University στην Αϊόβα που είχαν μολυνθεί με SCN. Τα εναιωρήματα αυγών που εξήχθησαν από δείγματα εδάφους καθαρίστηκαν με φυγοκέντρηση σακχαρόζης και με τη νέα μέθοδο OptiPrep. Στη συνέχεια, τα παρασκευάσματα των αυγών χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν χειροκίνητα στο μικροσκόπιο καθώς και με τις δύο νέες μεθόδους απεικόνισης που αναπτύξαμε. Συγκρίθηκαν η ποσότητα των υπολειμμάτων στα δείγματα και ο αριθμός των αυγών από τις μεθόδους.
Η χρήση του OptiPrep για τον καθαρισμό δειγμάτων βελτίωσε σημαντικά την ανάκτηση αυγών (> 80%) σε σύγκριση με τη χρήση φυγοκέντρησης σακχαρόζης (<40%). Και τα αποτελέσματα που προέκυψαν και από τις δύο αυτοματοποιημένες μεθόδους μέτρησης αυγών συσχετίστηκαν σε μεγάλο βαθμό με τον αριθμό των αυγών από άμεσες παρατηρήσεις με μικροσκόπιο. Οι αυτοματοποιημένες μας μέθοδοι μέτρησης αυγών απαιτούσαν ελάχιστη ανθρώπινη παρέμβαση μόνο κατά την προετοιμασία και τη φόρτωση του δείγματος. Το λογισμικό χειρίστηκε τις υπόλοιπες λειτουργίες σε ένα ευρύ φάσμα αριθμών αυγών (10 έως 300 αυγά ανά mL). Το κόστος του υλικού διατηρήθηκε σκόπιμα σε χαμηλά επίπεδα για ευρεία υιοθέτηση από τα εργαστήρια νηματολογίας, χρησιμοποιώντας εξαρτήματα εκτός ραφιού, κολλητικές ταινίες και τυπικά διηθητικά χαρτιά.
