Πώς είναι ένα ανθρώπινο γονίδιο ανασυνδυασμένο σε βακτηριακό πλασμίδιο;
1. Απόκτηση του ανθρώπινου γονιδίου ενδιαφέροντος
* Απομόνωση από το ανθρώπινο DNA: Το επιθυμητό ανθρώπινο γονίδιο εξάγεται από ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως η πέψη του ενζύμου περιορισμού ή η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης).
* Σύνθεση: Το γονίδιο μπορεί επίσης να συντίθεται τεχνητά, χρησιμοποιώντας τεχνολογία σύνθεσης γονιδίων, η οποία είναι συχνά πιο αποτελεσματική για σύνθετα γονίδια.
2. Προετοιμασία του διανυσματικού πλασμιδίου
* Επιλογή πλασμιδίου: Επιλέγεται ένας κατάλληλος φορέας πλασμιδίου, συχνά ένα με πολλαπλές θέσεις κλωνοποίησης (MCS), γονίδια αντοχής στα αντιβιοτικά και άλλα χαρακτηριστικά που διευκολύνουν την κλωνοποίηση.
* Περιορισμός ενζύμου πέψη: Το πλασμίδιο κόβεται ανοιχτό σε συγκεκριμένες θέσεις χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού, δημιουργώντας "κολλώδη άκρα" που είναι συμβατά με το ανθρώπινο γονίδιο.
3. Σύνδεση (ένωση) του γονιδίου και του πλασμιδίου
* Συμβατότητα: Τα κολλώδη άκρα του ανθρώπινου γονιδίου και του γραμμικοποιημένου πλασμιδίου έχουν σχεδιαστεί για να είναι συμβατά, επιτρέποντάς τους να δεσμεύονται μαζί μέσω συμπληρωματικής ζεύξης βάσεων.
* ένζυμο λιγάσης: Η λιγάση ϋΝΑ χρησιμοποιείται για την καταλύτη του σχηματισμού δεσμών φωσφοδιεστέρα, που ενώνουν μόνιμα το ανθρώπινο γονίδιο στο πλασμίδιο.
4. Μετασχηματισμός σε βακτήρια
* αρμόδια κύτταρα: Τα βακτηριακά κύτταρα γίνονται "ικανά" για να αναλάβουν το DNA με διάφορες μεθόδους, όπως θερμικό σοκ ή ηλεκτροδιάτρηση.
* Εισαγωγή: Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια εισάγονται στα αρμόδια βακτηρίδια.
* Επιλογή: Τα βακτήρια που έχουν πάρει με επιτυχία το πλασμίδιο επιλέγονται με την καλλιέργεια τους σε μέσα που περιέχουν αντιβιοτικά. Μόνο τα βακτήρια με το πλασμίδιο θα αναπτυχθούν λόγω του γονιδίου αντοχής στα αντιβιοτικά.
5. Επαλήθευση και επιβεβαίωση
* Colony PCR: Η PCR χρησιμοποιείται για να επιβεβαιώσει την παρουσία του ανθρώπινου γονιδίου εντός των βακτηριακών αποικιών.
* αλληλουχία: Η αλληλουχία γονιδίου που εισάγεται επαληθεύεται με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA για να εξασφαλιστεί ότι είναι σωστή και άθικτη.
Βασικά στοιχεία και σκέψεις:
* Ένζυμα περιορισμού: Αυτά τα ένζυμα κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες, δημιουργώντας συμβατά άκρα για σύνδεση.
* Ligase DNA: Αυτό το ένζυμο ενώνει τα άκρα των κλώνων DNA μαζί.
* δείκτες αντοχής στα αντιβιοτικά: Αυτά τα γονίδια στο πλασμίδιο επιτρέπουν την επιλογή βακτηρίων που έχουν ενσωματώσει με επιτυχία το πλασμίδιο.
* MCS (πολλαπλές τοποθεσίες κλωνοποίησης): Αυτή η περιοχή του πλασμιδίου περιέχει πολλαπλές θέσεις ενζύμου περιορισμού, επιτρέποντας την εισαγωγή διαφορετικών γονιδίων.
Γιατί είναι αυτό σημαντικό;
* Παραγωγή πρωτεϊνών: Τα ανασυνδυασμένα βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων ανθρώπινων πρωτεϊνών, όπως η ινσουλίνη ή η αυξητική ορμόνη, για θεραπευτικούς σκοπούς.
* Εργαλεία έρευνας: Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια είναι απαραίτητα για μελέτες γονιδιακής κλωνοποίησης και γονιδιακής έκφρασης.
* Γονιδιακή θεραπεία: Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που περιέχουν θεραπευτικά γονίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παροχή διορθωτικών γονιδίων σε κύτταρα σε γονιδιακή θεραπεία.
Σημείωση: Οι συγκεκριμένες λεπτομέρειες της διαδικασίας μπορεί να ποικίλουν ανάλογα με το γονίδιο που κλωνοποιείται, τον βακτηριακό ξενιστή και την επιθυμητή εφαρμογή.
