Πώς οι βιολόγοι απομονώνουν τα κυτταρικά συστατικά;
1. Διαταραχή των κυττάρων:
* Μηχανικές μέθοδοι:
* ομογενοποίηση: Χρησιμοποιώντας ένα μπλέντερ ή έναν ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας για να σπάσει φυσικά ανοιχτά κύτταρα.
* Sonication: Χρησιμοποιώντας ηχητικά κύματα για να διαταράξετε τις κυτταρικές μεμβράνες.
* Γαλλικός Τύπος: Αναγκάζοντας τα κύτταρα μέσω ενός μικρού ανοίγματος κάτω από υψηλή πίεση.
* λείανση: Χρησιμοποιώντας ένα κονίαμα και ένα γουδοχέρι για να σπάσει φυσικά τα κύτταρα.
* Χημικές μέθοδοι:
* απορρυπαντικά: Διαταράξτε τις κυτταρικές μεμβράνες διαλύοντας τα λιπίδια.
* ένζυμα: Χρησιμοποιήστε συγκεκριμένα ένζυμα όπως η λυσοζύμη για να υποβαθμίσετε τα κυτταρικά τοιχώματα.
* Οσμωτικό σοκ: Αλλαγή της οσμωτικής πίεσης του διαλύματος για να διαταράξει τις κυτταρικές μεμβράνες.
2. Διαφορική φυγοκέντρηση:
* Μετά τη διαταραχή των κυττάρων, το κυτταρικό λύση περιστρέφεται σε αυξανόμενες ταχύτητες και διάρκειες. Αυτό διαχωρίζει τα εξαρτήματα με βάση το μέγεθος και την πυκνότητα τους.
* φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας: Στενάζματα μεγαλύτερα εξαρτήματα όπως πυρήνες και κυτταρικά συντρίμμια.
* φυγοκέντρηση μέσης ταχύτητας: Μιτοχόνδρια και λυσοσώματα.
* φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας: Μικροσώματα και ριβοσώματα σφαιριδίων.
* Ultracentrifugation: Σφίξτε μικρότερα συστατικά όπως πρωτεΐνες και νουκλεϊνικά οξέα.
3. Φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας:
* Αυτή η μέθοδος βελτιώνει περαιτέρω τον διαχωρισμό που επιτυγχάνεται με διαφορική φυγοκέντρηση. Μια κλίση σακχαρόζης ή άλλων ουσιών δημιουργείται σε ένα σωλήνα και το κυτταρικό λύμα είναι στρωματοποιημένο στην κορυφή. Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης, τα συστατικά κινούνται μέσω της κλίσης μέχρι να φτάσουν σε μια πυκνότητα ίση με τη δική τους.
* Τύποι:
* κλίση σακχαρόζης: Χρησιμοποιείται συνήθως για τον διαχωρισμό των οργανιδίων.
* κλίση χλωριούχου καισίου: Εξαιρετική για την απομόνωση του DNA και του RNA.
4. Χρωματογραφία συγγένειας:
* Αυτή η μέθοδος εκμεταλλεύεται τη συγκεκριμένη δέσμευση ενός μορίου στόχου σε ένα ακινητοποιημένο συνδέτη σε μια στήλη.
* προσδέτης: Ένα μόριο που δεσμεύεται ειδικά με το μόριο -στόχο.
* Στήλη: Μια συμπαγής μήτρα με τον ακινητοποιημένο συνδέτη.
* Έκλειψη: Μετά τη δέσμευση, το μόριο στόχου εκλούστηκε από τη στήλη χρησιμοποιώντας μια συγκεκριμένη λύση.
5. Ηλεκτροφόρηση:
* Χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών με βάση το μέγεθος και τη φόρτιση και τα νουκλεϊνικά οξέα με βάση το μέγεθος.
* SDS-PAGE: Διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση το μέγεθος.
* ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης: Διαχωρίζει τα νουκλεϊνικά οξέα με βάση το μέγεθος.
6. Ανοσοκαταβύθιση:
* Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί αντισώματα για την απομόνωση συγκεκριμένων πρωτεϊνών.
* Αντισώματα: Δεσμεύονται σε μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη ενδιαφέροντος.
* βροχόπτωση: Μετά τη δέσμευση, το σύμπλεγμα πρωτεΐνης-αντισώματος καταβυθίζεται εκτός διαλύματος.
7. Κυτταρομετρία ροής:
* Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί λέιζερ και φθορίζοντες ανιχνευτές για την ανάλυση και ταξινόμηση κυττάρων ή κυτταρικών συστατικών με βάση τα φυσικά και βιολογικά χαρακτηριστικά τους.
Παράδειγμα:απομόνωση μιτοχονδρίων
* Τα κύτταρα διαταράσσονται χρησιμοποιώντας ομογενοποίηση ή γαλλικό τύπο.
* Το κυτταρικό λύμα φυγοκεντρείται με μέση ταχύτητα για μιτοχόνδρια με σφαιρίδια.
* Το σφαιρίδιο επαναιωρείται και καθαρίζεται περαιτέρω χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας.
Η επιλογή της μεθόδου εξαρτάται από τον συγκεκριμένο τύπο κυττάρου, το οργανίδιο ή το μόριο ενδιαφέροντος και το επιθυμητό επίπεδο καθαρότητας. Κάθε τεχνική έχει τα πλεονεκτήματα και τις αδυναμίες της και οι ερευνητές χρησιμοποιούν συχνά ένα συνδυασμό μεθόδων για να αποκτήσουν τα επιθυμητά αποτελέσματα.
