Τι πρέπει να κάνει ο επιστήμονας για να βρει το γονίδιο που παράγει πρωτεΐνη αφού βρήκε όλο το mRNA που παράγεται από το ήπαρ και το cDNA, αν θέλει να παράγει τεχνικά τα βατράχια;
1. Απομόνωση mRNA από το ήπαρ
* Συλλογή ιστών: Ο επιστήμονας θα έλαβε τον ηπατικό ιστό από ένα ζώο (ιδανικά ένα είδος παρόμοιο με τον βάτραχο, αλλά μπορεί να είναι ένα διαφορετικό είδος εάν είναι απαραίτητο).
* Εκχύλιση RNA: Θα χρησιμοποιούσαν τυποποιημένες τεχνικές για την εξαγωγή ολικού RNA από τον ήπαρ. Αυτό το RNA θα περιλαμβάνει τόσο mRNA όσο και άλλους τύπους RNA.
* Απομόνωση mRNA: Στη συνέχεια θα καθαρίσουν το mRNA χρησιμοποιώντας μια τεχνική που ονομάζεται επιλογή Poly-A. Αυτή η διαδικασία εκμεταλλεύεται το γεγονός ότι τα περισσότερα mRNA έχουν μια ουρά poly-A στο 3 'END.
2. Δημιουργία βιβλιοθήκης cDNA
* Αντίστροφη μεταγραφή: Χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση, ο επιστήμονας θα μετατρέψει το απομονωμένο mRNA σε συμπληρωματικό DNA (cDNA). Αυτό το cDNA αντιπροσωπεύει τις αλληλουχίες κωδικοποίησης των γονιδίων που εκφράζονται στο ήπαρ.
* κλωνοποίηση: Τα μόρια cDNA θα κλωνοποιηθούν σε ένα διάνυσμα (π.χ. πλασμίδιο ή βακτηριοφάγος) για να δημιουργηθεί μια βιβλιοθήκη cDNA. Αυτή η βιβλιοθήκη αποθηκεύει ουσιαστικά όλα τα γονίδια που εκφράζονται στο ήπαρ.
3. Προσδιορισμός του γονιδίου ενδιαφέροντος
* αλληλουχία mRNA (RNA-seq): Ο επιστήμονας θα μπορούσε να ακολουθήσει όλα τα mRNA στο ήπαρ. Συγκρίνοντας τις αλληλουχίες με μια βάση δεδομένων γνωστών γονιδίων, μπορούν να προσδιορίσουν το mRNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος.
* Ανάλυση διαφορικής οθόνης ή μικροσυστοιχίας: Αυτές οι τεχνικές επιτρέπουν στον επιστήμονα να συγκρίνει τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης στο ήπαρ (όπου παράγεται η πρωτεΐνη) σε άλλους ιστούς. Αυτό μπορεί να βοηθήσει να εντοπιστούν τα γονίδια που εκφράζονται ειδικά στο ήπαρ.
* Προβολή αντισωμάτων: Εάν η πρωτεΐνη είναι ήδη γνωστή, ο επιστήμονας θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει αντισώματα που δεσμεύονται ειδικά με την πρωτεΐνη για να ανιχνευθούν η βιβλιοθήκη cDNA. Αυτό θα αναγνωρίσει άμεσα τον κλώνο cDNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη.
4. Έκφραση σε κύτταρα βάτραχος
* κλωνοποίηση γονιδίων: Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος, που τώρα αναγνωρίζεται στη βιβλιοθήκη cDNA, πρέπει να απομονωθεί και να κλωνοποιηθεί σε ένα φορέα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να το παραδώσει σε κύτταρα βατράχου.
* Επιλογή φορέα: Ο φορέας πρέπει να περιέχει τα απαραίτητα ρυθμιστικά στοιχεία (προαγωγό, σήμα πολυαδενυλίωσης) για να εξασφαλιστεί ότι το γονίδιο μεταγράφεται και μεταφράζεται σε κύτταρα βατράχου.
* επιμόλυνση/έγχυση: Ο φορέας που περιέχει το γονίδιο εισάγεται σε κύτταρα βατράχου. Υπάρχουν διαφορετικές μέθοδοι για αυτό:
* επιμόλυνση: Χρησιμοποιώντας χημικές ουσίες ή άλλες μεθόδους για την παράδοση του φορέα σε καλλιεργημένα κύτταρα βατράχου.
* έγχυση: Ενείνοντας απευθείας τον φορέα σε έμβρυα βάτραχου ή αναπτυσσόμενους ιστούς.
* επαλήθευση: Ο επιστήμονας θα πρέπει να επαληθεύσει ότι η πρωτεΐνη παράγεται στα κύτταρα βάτραχου:
* Ανοσοφθορισμό: Χρησιμοποιώντας φθορίζοντα αντισώματα για την ανίχνευση της πρωτεΐνης μέσα στα κύτταρα.
* στύπωμα Western: Χρησιμοποιώντας αντισώματα για την ανίχνευση της πρωτεΐνης σε κυτταρολύματα.
* Λειτουργικές δοκιμασίες: Δοκιμάζοντας εάν η πρωτεΐνη έχει την αναμενόμενη βιολογική δραστηριότητα στα κύτταρα βάτραχου.
Βασικές εκτιμήσεις:
* Διαφορές ειδών: Ενώ το γονίδιο μπορεί να βρεθεί σε διαφορετικό είδος, μπορεί να υπάρχουν διαφορές στον τρόπο με τον οποίο ρυθμίζεται ή εκφράζεται σε βατράχους. Αυτό μπορεί να απαιτεί προσαρμογές στον φορέα ή σε άλλες πειραματικές συνθήκες.
* Κανονισμός γονιδίων: Ο επιστήμονας θα πρέπει να εξετάσει τα ρυθμιστικά στοιχεία που ελέγχουν την έκφραση του γονιδίου στον βάτραχο. Αυτά μπορεί να διαφέρουν από το αρχικό είδος.
* Ηθικές ανησυχίες: Η έρευνα που περιλαμβάνει ζωικά μοντέλα απαιτεί προσεκτική εξέταση των δεοντολογικών επιπτώσεων.
Επιτρέψτε μου να ξέρω αν θέλετε να επεκταθώ σε κάποιο συγκεκριμένο βήμα ή πτυχή!
