Πώς μπορεί ένας βιολόγος να καθορίσει εάν έχει συμβεί μετάλλαξη;
1. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ DNA:
* Άμεση αλληλουχία: Αυτή είναι η πιο συνηθισμένη και απλή μέθοδος. Η περιοχή ενδιαφέροντος DNA ενισχύεται χρησιμοποιώντας PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) και στη συνέχεια προσδιορίζεται με τη χρήση αυτοματοποιημένων τεχνικών προσδιορισμού αλληλουχίας. Η ακολουθία στη συνέχεια συγκρίνεται με μια ακολουθία αναφοράς (συνήθως μια άγρια ή κανονική ακολουθία). Οποιεσδήποτε διαφορές στις αλληλουχίες υποδεικνύουν μια μετάλλαξη.
* αλληλουχία επόμενης γενιάς (NGS): Πρόκειται για μια τεχνολογία αλληλουχίας υψηλής απόδοσης που μπορεί να ακολουθήσει εκατομμύρια θραύσματα DNA ταυτόχρονα. Το NGS είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε μεγάλες περιοχές του γονιδιώματος ή για τον εντοπισμό μεταλλάξεων σε πληθυσμό κυττάρων.
2. Ηλεκτροφόρηση:
* Πολυμορφισμός μήκους θραύσματος περιορισμού (RFLP): Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί ένζυμα περιορισμού, τα οποία κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες. Εάν μια μετάλλαξη αλλάξει μια θέση περιορισμού, το μέγεθος των παραγόμενων θραυσμάτων DNA θα τροποποιηθεί. Αυτό μπορεί να απεικονιστεί χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής.
* Πολυμορφισμός διαμόρφωσης μονής κλώνης (SSCP): Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί το γεγονός ότι μόρια ϋΝΑ με ένα έλλειμμα με μεταλλάξεις διπλώνουν διαφορετικά. Τα διαφορετικά διπλωμένα μόρια μεταναστεύουν διαφορετικά σε ένα πήκτωμα, επιτρέποντας την ανίχνευση μεταλλάξεων.
3. Μοριακές δοκιμασίες:
* Ειδική αλλήλιο ολιγονουκλεοτιδίου (ASO) υβριδισμός: Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί ανιχνευτές σύντομων ϋΝΑ που είναι συμπληρωματικοί σε συγκεκριμένα αλληλόμορφα. Οι ανιχνευτές που ταιριάζουν με το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο θα υβριδοποιούνται στο DNA, ενώ οι ανιχνευτές που ταιριάζουν με το αλλήλιο άγριου τύπου δεν θα το κάνουν.
* Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με ειδικά εκκινητές μετάλλαξης: Οι εκκινητές PCR έχουν σχεδιαστεί για να ενισχύουν ειδικά το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. Εάν υπάρχει η μετάλλαξη, το προϊόν PCR θα ενισχυθεί, ενώ δεν θα ενισχυθεί εάν η μετάλλαξη απουσιάζει.
4. Φαινοτυπική ανάλυση:
* Αλλαγές σε παρατηρήσιμα χαρακτηριστικά: Ορισμένες μεταλλάξεις οδηγούν σε παρατηρήσιμες αλλαγές στον φαινότυπο του οργανισμού, όπως οι αλλαγές στο χρώμα, το μέγεθος ή τη συμπεριφορά. Αυτές οι αλλαγές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό ατόμων με μεταλλάξεις.
* Λειτουργικές δοκιμασίες: Αυτό περιλαμβάνει τη δοκιμή της δραστικότητας μιας πρωτεΐνης ή ενός ενζύμου που κωδικοποιείται από το μεταλλαγμένο γονίδιο. Εάν η πρωτεΐνη ή το ένζυμο είναι μη λειτουργικό ή έχει τροποποιήσει τη δραστηριότητα, αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό της μετάλλαξης.
5. Τεχνικές κυτταρικής καλλιέργειας:
* Αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές: Ορισμένες κυτταρικές σειρές μπορούν να καλλιεργηθούν στο εργαστήριο και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη μεταλλάξεων. Αυτές οι κυτταρικές σειρές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διερεύνηση των επιδράσεων των μεταλλάξεων στην κυτταρική ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και άλλες κυτταρικές διεργασίες.
* Τεχνολογίες επεξεργασίας γονιδίων: Εργαλεία όπως το CRISPR-CAS9 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή συγκεκριμένων μεταλλάξεων σε κυτταρικές σειρές, επιτρέποντας τη μελέτη των επιδράσεων της μετάλλαξης.
6. Μελέτες πληθυσμού:
* Συχνότητα μετάλλαξης: Μελετώντας τη συχνότητα των μεταλλάξεων σε έναν πληθυσμό, οι βιολόγοι μπορούν να εντοπίσουν μεταλλάξεις που σχετίζονται με συγκεκριμένες ασθένειες ή φαινότυπους.
* Γενετική πληθυσμού: Οι γενετικές μελέτες του πληθυσμού μπορούν να παρακολουθήσουν την εξέλιξη των μεταλλάξεων με την πάροδο του χρόνου και τον αντίκτυπό τους στη συνολική καταλληλότητα του πληθυσμού.
Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί εάν έχει συμβεί μετάλλαξη, θα ποικίλλει ανάλογα με το συγκεκριμένο πλαίσιο και το ερευνητικό ερώτημα που εξετάζεται. Ο συνδυασμός πολλαπλών προσεγγίσεων μπορεί συχνά να παρέχει πιο ισχυρές ενδείξεις για την παρουσία μιας μετάλλαξης.
