Πώς εντοπίζετε το ένζυμο περιορισμού;
1. Κατανόηση των βασικών
* Ένζυμα περιορισμού: Αυτά είναι βακτηριακά ένζυμα που κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες που ονομάζονται "θέσεις αναγνώρισης".
* Ιστοσελίδα αναγνώρισης: Μια σύντομη αλληλουχία DNA (τυπικά 4-8 ζεύγη βάσεων) που αναγνωρίζει και δεσμεύεται ένα ένζυμο περιορισμού.
* Κόψτε την τοποθεσία: Η συγκεκριμένη θέση εντός της ακολουθίας αναγνώρισης όπου το ένζυμο διασπά το DNA.
2. Μέθοδοι ταυτοποίησης
* Αναζήτηση βάσης δεδομένων:
* rebase: Η πιο ολοκληρωμένη βάση δεδομένων των ενζύμων περιορισμού ([https://rebase.neb.com/] Αναζήτηση με όνομα ενζύμου, ακολουθία αναγνώρισης ή άλλα κριτήρια.
* New England Biolabs (NEB): Παρέχει εκτεταμένες πληροφορίες σχετικά με τον κατάλογο των ενζύμων περιορισμού τους, συμπεριλαμβανομένων των ιστότοπων αναγνώρισης, των απαιτήσεων buffer και άλλων.
* Thermo Fisher Scientific: Ένας άλλος σημαντικός προμηθευτής με έναν ολοκληρωμένο ηλεκτρονικό κατάλογο.
* Πειραματικός προσδιορισμός:
* ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ DNA: Προσδιορίστε την ακριβή αλληλουχία DNA μιας περιοχής που υποπτεύεται ότι περιέχει μια θέση περιορισμού.
* Ανάλυση Digest Cimportation: Χαλαρώστε το DNA με ένα γνωστό ένζυμο περιορισμού και αναλύστε τα θραύσματα που προκύπτουν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής. Το μέγεθος και ο αριθμός των θραυσμάτων μπορούν να υποδεικνύουν την παρουσία και τη θέση των θέσεων περιορισμού.
3. Βασικές πληροφορίες για τον εντοπισμό ενός ενζύμου περιορισμού
* ακολουθία αναγνώρισης: Η ειδική αλληλουχία DNA που αναγνωρίζει το ένζυμο (π.χ., 5'-Gaattc-3 ').
* Κόψτε την τοποθεσία: Η ακριβής θέση εντός της αλληλουχίας αναγνώρισης όπου το ένζυμο διασπά (π.χ. μεταξύ του G και του Α στο παραπάνω παράδειγμα).
* Σχέδιο διάσπασης: Πώς το ένζυμο κόβει το DNA:
* αμβλύ τελειώνει: Δημιουργεί μια καθαρή περικοπή χωρίς προεξοχές.
* Sticky Ends: Δημιουργεί κλιμακωτές περικοπές με προεξοχές που μπορούν να συνδυαστούν με συμπληρωματικές ακολουθίες.
* Απαιτήσεις buffer: Το βέλτιστο ρΗ, η συγκέντρωση άλατος και άλλες καταστάσεις που απαιτούνται για την ενζυμική δραστηριότητα.
4. Επιλέγοντας ένα ένζυμο περιορισμού
* ακολουθία στόχου: Προσδιορίστε τη συγκεκριμένη ακολουθία που θέλετε να κόψετε.
* επιθυμητά άκρα: Αποφασίστε εάν χρειάζεστε αμβλύ ή κολλώδη άκρα για την αίτησή σας.
* Συμβατότητα: Βεβαιωθείτε ότι το επιλεγμένο ένζυμο είναι συμβατό με τις πειραματικές συνθήκες σας (ρυθμιστικά, θερμοκρασία).
Παράδειγμα:
Ας πούμε ότι χρειάζεστε ένα ένζυμο περιορισμού που αναγνωρίζει την ακολουθία 5'-ggatcc-3 'και δημιουργεί κολλώδη άκρα. Με την αναζήτηση μιας βάσης δεδομένων όπως η Rebase, θα διαπιστώσετε ότι το ένζυμο BAMHI έχει αυτή την ακολουθία αναγνώρισης και περικοπές μεταξύ του G και του G, δημιουργώντας κολλώδη άκρα.
Σημαντική σημείωση: Συμβουλευτείτε πάντα το φύλλο πληροφοριών προϊόντων που παρέχεται από τον κατασκευαστή για λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού.
