Πώς μπαίνει ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο στο βακτήριο;

Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια χρησιμοποιώντας μια διαδικασία που ονομάζεται μετασχηματισμός . Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

1. Προετοιμασία των βακτηρίων:

* Τα βακτήρια αναπτύσσονται σε ένα μέσο πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά μέχρι να φτάσουν σε μια συγκεκριμένη φάση ανάπτυξης (συνήθως η φάση log).

* Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβάλλονται σε αγωγή με χλωριούχο ασβέστιο (CaCl2) . Αυτή η θεραπεία καθιστά τη βακτηριακή κυτταρική μεμβράνη πιο διαπερατή, αυξάνοντας την πιθανότητα πρόσληψης DNA.

2. Εισαγωγή του πλασμιδίου:

* Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο DNA αναμειγνύεται με τα επεξεργασμένα βακτήρια.

* Αυτό το μείγμα στη συνέχεια υποβάλλεται σε ένα θερμικό σοκ (συνήθως 42 ° C για μικρό χρονικό διάστημα). Αυτό το θερμικό σοκ αυξάνει περαιτέρω τη διαπερατότητα της μεμβράνης και επιτρέπει στο πλασμίδιο να εισέλθει στο βακτηριακό κύτταρο.

3. Επιλογή μετασχηματισμένων βακτηρίων:

* Δεν θα αναλάβουν όλα τα βακτήρια το πλασμίδιο DNA. Για να προσδιορίσετε τα μετασχηματισμένα βακτήρια, το πλασμίδιο περιέχει ένα γονίδιο δείκτη . Αυτό το γονίδιο συνήθως προσδίδει αντοχή στα αντιβιοτικά.

* Τα βακτήρια είναι τοποθετημένα σε ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει το αντίστοιχο αντιβιοτικό. Μόνο τα βακτήρια που έχουν πάρει το πλασμίδιο και εκφράζουν το γονίδιο αντοχής στα αντιβιοτικά θα είναι σε θέση να αναπτυχθεί.

4. Επιβεβαίωση της ενσωμάτωσης του πλασμιδίου:

* Για να επιβεβαιωθεί ότι τα βακτήρια έχουν ενσωματώσει επιτυχώς το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, συνήθως εκτελείται περαιτέρω ανάλυση. Αυτό μπορεί να περιλαμβάνει:

* PCR: Ενισχύοντας ένα συγκεκριμένο θραύσμα γονιδίων από το πλασμίδιο για να επιβεβαιώσει την παρουσία του.

* Περιορισμός ενζύμου πέψη: Κοπή του πλασμιδίου DNA με συγκεκριμένα ένζυμα για να ελέγξει την παρουσία του επιθυμητού γονιδιακού ένθετου.

* αλληλουχία: Προσδιορισμός της αλληλουχίας του πλασμιδίου DNA για να επαληθεύσει τη σωστή εισαγωγή του γονιδίου.

Συνολικά, ο μετασχηματισμός είναι μια εξαιρετικά αποτελεσματική μέθοδος για την εισαγωγή ανασυνδυασμένων πλασμιδίων σε βακτήρια. Επιλέγοντας για μετασχηματισμένα βακτήρια και επιβεβαιώνοντας την παρουσία του πλασμιδίου, οι ερευνητές μπορούν να εξασφαλίσουν ότι η επιθυμητή γενετική τροποποίηση έχει επιτευχθεί με επιτυχία.

Σημείωση: Υπάρχουν και άλλες μέθοδοι για την εισαγωγή του DNA σε βακτήρια, όπως Electroporation , η οποία χρησιμοποιεί ηλεκτρικό παλμό για να δημιουργήσει πόρους στην κυτταρική μεμβράνη και μεταγωγή , η οποία χρησιμοποιεί ιούς για να φέρει το DNA. Ωστόσο, ο μετασχηματισμός παραμένει η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική λόγω της απλότητας και της αποτελεσματικότητάς του.