Πώς χρησιμοποιείται ο μετασχηματισμός για την κατασκευή ανασυνδυασμένων μορίων DNA;
Τι είναι ο μετασχηματισμός;
Ο μετασχηματισμός είναι η διαδικασία όπου ένα κελί παίρνει το ξένο DNA από το περιβάλλον του. Αυτό το DNA μπορεί να έχει τη μορφή πλασμιδίων, τα οποία είναι μικρά κυκλικά κομμάτια DNA που βρίσκονται σε βακτήρια, ή μπορεί να είναι γραμμικό DNA. Μόλις μέσα στο κύτταρο, το ξένο DNA μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του κυττάρου του ξενιστή ή μπορεί να υπάρχει ως ξεχωριστή οντότητα (όπως ένα πλασμίδιο).
μετασχηματισμός σε ανασυνδυασμένη κατασκευή DNA:
1. Ξεκινάτε με ένα θραύσμα ϋΝΑ που ενδιαφέρει (το γονίδιο που θέλετε να εκφράσετε) και ένα διάνυσμα (συνήθως ένα πλασμίδιο). Αυτά κόβονται με ένζυμα περιορισμού, δημιουργώντας συμβατά κολλώδη άκρα. Το γονίδιο στη συνέχεια συνδέεται (ενώνει) στον φορέα, δημιουργώντας το ανασυνδυασμένο μόριο DNA.
2. Προετοιμασία για μετασχηματισμό: Τα κύτταρα ξενιστή γίνονται ικανά, πράγμα που σημαίνει ότι είναι πιο πιθανό να αναλάβουν το DNA. Αυτό γίνεται με τη θεραπεία τους με χημικά όπως το χλωριούχο ασβέστιο ή εκθέτοντάς τα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο (ηλεκτροδιάτρηση).
3. Εισαγωγή του ανασυνδυασμένου DNA: Το ανασυνδυασμένο μόριο ϋΝΑ (συνήθως σε μορφή πλασμιδίου) αναμειγνύεται με τα αρμόδια κύτταρα ξενιστή. Αυτό το μίγμα επωφελείται στη συνέχεια υπό συγκεκριμένες συνθήκες για να επιτρέψει στα κύτταρα να αναλάβουν το DNA.
4. Επιλογή: Δεν είναι όλα τα κύτταρα επιτυχώς αναλαμβάνουν το ανασυνδυασμένο DNA. Για να προσδιοριστούν τα μετασχηματισμένα κύτταρα, ο φορέας περιέχει συνήθως ένα επιλέξιμο γονίδιο δείκτη, όπως η αντίσταση στα αντιβιοτικά. Μετά τον μετασχηματισμό, τα κύτταρα καλλιεργούνται σε μέσο που περιέχει αντιβιοτικά. Μόνο τα κύτταρα που έχουν πάρει το πλασμίδιο με το γονίδιο αντίστασης στα αντιβιοτικά θα επιβιώσουν.
Γιατί ο μετασχηματισμός είναι σημαντικός;
* Έκφραση του γονιδίου: Μόλις μέσα στο κύτταρο, το ανασυνδυασμένο ϋΝΑ μπορεί να μεταγραφεί και να μεταφραστεί, οδηγώντας στην παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης.
* Αντιγραφή του γονιδίου: Τα μετασχηματισμένα κύτταρα θα αναπαραχθούν και το ανασυνδυασμένο DNA θα αντιγραφεί μαζί με το DNA του κυττάρου του ξενιστή, επιτρέποντας την παραγωγή πολλών αντιγράφων του γονιδίου.
* Μελέτη και εφαρμογή: Τα μετασχηματισμένα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη της λειτουργίας του γονιδίου, την παραγωγή πολύτιμων πρωτεϊνών ή για άλλες εφαρμογές όπως η γονιδιακή θεραπεία.
Τύποι μετασχηματισμού:
* Χημικός μετασχηματισμός: Πρόκειται για μια συνηθισμένη μέθοδο όπου τα κύτταρα αντιμετωπίζονται με χλωριούχο ασβέστιο, γεγονός που καθιστά τις μεμβράνες τους πιο διαπερατές στο DNA.
* Ηλεκτροδιάκριση: Σε αυτή τη μέθοδο, τα κύτταρα εκτίθενται σε ένα σύντομο ηλεκτρικό παλμό που δημιουργεί προσωρινούς πόρους στις μεμβράνες τους, επιτρέποντας στην είσοδο του DNA.
* μεταγωγή ιού: Οι ιοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς για την παροχή ξένου DNA σε κύτταρα. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται συχνά στη γονιδιακή θεραπεία.
Συνοπτικά, ο μετασχηματισμός είναι ένα κρίσιμο βήμα στη γενετική μηχανική, επιτρέποντας στους επιστήμονες να εισάγουν ανασυνδυασμένο DNA σε κύτταρα και να αξιοποιήσουν τα μηχανήματα του κυττάρου για να εκφράσουν και να αναπαράγουν το γονίδιο ενδιαφέροντος.
