Μοριακή Κλωνοποίηση
Βασικές έννοιες
Σε αυτό το άρθρο, θα μάθετε για μια θεμελιώδη τεχνική ενίσχυσης του DNA που ονομάζεται Μοριακή Κλωνοποίηση. Ας εξερευνήσουμε τη βιοχημεία πίσω από τη διαδικασία, καθώς και ορισμένες σημαντικές εφαρμογές.
Μελέτη DNA
Στους διάφορους κλάδους της βιολογίας και της βιοχημείας, η ανάλυση του DNA διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κατανόηση των βιολογικών συστημάτων. Ωστόσο, οι αλληλουχίες DNA μπορούν πραγματικά να αναλυθούν μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις, χρησιμοποιώντας μεθόδους όπως τρέξιμο τζελ ή μέτρηση της απορρόφησης φωτός. Αυτό παρουσιάζει δυσκολίες για τους επιστήμονες που ενδιαφέρονται για συγκεκριμένα γονίδια ή αλληλουχίες. Εξάλλου, ένα ανθρώπινο γονίδιο έχει συνήθως, το πολύ, μια χούφτα αντίγραφα μέσα σε ένα κύτταρο. Τέτοιες χαμηλές συγκεντρώσεις αποδίδουν λίγες πληροφορίες αλληλουχίας σε έναν ενδιαφερόμενο επιστήμονα.
Έτσι, από τότε που το DNA έγινε μόριο ενδιαφέροντος για τους επιστήμονες, οι τεχνικές αντιγραφής και παραγωγής μεγάλων ποσοτήτων αλληλουχιών DNA παρέμειναν κρίσιμες. Πράγματι, οι διαδικασίες ενίσχυσης του DNA έχουν μεγάλη ποικιλία σημαντικών εφαρμογών, όπως η γενετική τροποποίηση, η βιομηχανική παραγωγή φαρμάκων, ο έλεγχος παθογόνων, ο γενετικός έλεγχος και η λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA.
Για να κατανοήσουμε πώς εκτελείται κάθε μία από αυτές τις εφαρμογές, ας ρίξουμε μια ματιά σε μία από τις πιο σημαντικές τεχνικές ενίσχυσης, τη μοριακή κλωνοποίηση. Εάν θέλετε να μάθετε για μια άλλη σημαντική τεχνική, ανατρέξτε στο άρθρο μας για την PCR.
Μοριακή κλωνοποίηση
Η μοριακή κλωνοποίηση εκμεταλλεύεται την αντιγραφή του DNA που τα βακτήρια εκτελούν φυσικά. Συγκεκριμένα, περιλαμβάνει την τοποθέτηση μιας επιθυμητής αλληλουχίας σε ζωντανά βακτηριακά κύτταρα και τη δυνατότητα να αναπαραχθούν πολλές φορές. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε εκατομμύρια βακτήρια που το καθένα έχει μια επιθυμητή αλληλουχία DNA.
Εκτός από ένα ζωντανό στέλεχος βακτηρίων (συνήθως E. coli ), χρειάζεστε δύο σημαντικά συστατικά για να χρησιμοποιήσετε αποτελεσματικά τη μοριακή κλωνοποίηση:
- Διάνυσμα κλωνοποίησης
- Ενδονουκλεάση περιορισμού
Ένας φορέας κλωνοποίησης είναι ένα σύντομο τμήμα DNA που φέρει την επιθυμητή αλληλουχία που πρέπει να αντιγραφεί. Στη φύση, τα βακτήρια προσλαμβάνουν μικρά κομμάτια DNA, που ονομάζονται πλασμίδια, μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται μεταγωγή. Αυτό περιλαμβάνει τη μεταφορά του DNA μέσω της βακτηριακής μεμβράνης και του κυτταρικού τοιχώματος. Μόλις μπουν μέσα, τα βακτήρια μπορούν να εκφράσουν γονίδια στο πλασμίδιο, καθώς και να αντιγραφούν και να περάσουν το πλασμίδιο στα θυγατρικά κύτταρα. Συχνά, οι φορείς κλωνοποίησης περιέχουν ένα γονίδιο αντίστασης στα αντιβιοτικά χρήσιμο για την επιλογή βακτηρίων που μετέφεραν με επιτυχία την αλληλουχία σας.
Μια περιοριστική ενδονουκλεάση είναι ένα ένζυμο που κόβει το DNA σε ορισμένες αλληλουχίες. Η συγκεκριμένη αλληλουχία στην οποία συνδέεται και κόβει ένα ένζυμο περιορισμού ονομάζεται «θέση αναγνώρισής του». Είναι ενδιαφέρον ότι αυτά τα ένζυμα κόβουν τους δύο κλώνους του DNA σε διαφορετικά σημεία, δημιουργώντας ένα μικρό τμήμα μη ζευγαρωμένων νουκλεοτιδίων. Οι βιοχημικοί αποκαλούν αυτά τα μη ζευγαρωμένα τεντώματα "κολλώδη άκρα" επειδή ζευγαρώνουν εύκολα με συμπληρωματικές αλληλουχίες.
Για να κατανοήσουμε πώς αυτά τα συστατικά επιτρέπουν την ενίσχυση του DNA, πρέπει να ρίξουμε μια πιο προσεκτική ματιά στα βήματα της μοριακής κλωνοποίησης.
Πρώτο βήμα:Εισαγωγή της αλληλουχίας DNA σας
Για να ενισχύσετε αποτελεσματικά το DNA χρησιμοποιώντας μοριακή κλωνοποίηση, το πρώτο βήμα περιλαμβάνει την εισαγωγή της επιθυμητής αλληλουχίας στον φορέα κλωνοποίησης. Για να γίνει αυτό, πρέπει να επιλέξετε έναν φορέα κλωνοποίησης που περιέχει μια θέση αναγνώρισης για την επιλεγμένη ενδονουκλεάση. Πρέπει επίσης να δημιουργήσετε μια πολύ μικρή διπλή έλικα DNA που να περιλαμβάνει την αλληλουχία που σας ενδιαφέρει, καθώς και δύο από τις ίδιες τοποθεσίες αναγνώρισης ανάντη και κατάντη της ακολουθίας σας. Έτσι, όταν το ένζυμο περιορισμού σας διασπά τον φορέα κλωνοποίησης και την αλληλουχία που σας ενδιαφέρει, τα κολλώδη άκρα μπορούν να σχηματίσουν ζεύγος βάσεων. Στη συνέχεια, μια λιγκάση DNA μπορεί να καταλύσει την αντίδραση που ενώνει τους κλώνους του φορέα και την αλληλουχία μαζί.
Δεύτερο βήμα:Μεταφορά του πλασμιδίου σας σε βακτήρια
Δεύτερον, χρειάζεστε τα βακτηριακά σας κύτταρα για να προσλάβουν το πλασμίδιο της αλληλουχίας φορέα που μόλις φτιάξατε. Η μεταγωγή έχει συνήθως χαμηλή απόδοση. τα βακτήρια σπάνια προσλαμβάνουν ένα ξένο πλασμίδιο αυθόρμητα. Για να αυξήσετε τις πιθανότητες να προσλάβουν τα βακτήρια σας το πλασμίδιο σας, μπορείτε να εκτελέσετε ένα «θερμικό σοκ». Αυτό περιλαμβάνει τη διατήρηση της καλλιέργειας των βακτηρίων σας κρύα για μεγάλο χρονικό διάστημα και στη συνέχεια την ταχεία αύξηση της θερμοκρασίας. Στην πράξη, ένα αποτελεσματικό θερμικό σοκ θα ήταν μια γρήγορη βύθιση σε ζεστό προς καυτό νερό αφού κρατήσετε το σωλήνα των βακτηρίων στον πάγο για λίγο. Τα θερμικά σοκ χρησιμεύουν για την αύξηση της διαπερατότητας των βακτηριακών κυτταρικών τοιχωμάτων, γεγονός που αυξάνει την αποτελεσματικότητα της μεταγωγής. Ωστόσο, ακόμη και με θερμικό σοκ, σχετικά λίγα βακτήρια στην καλλιέργεια θα πραγματοποιήσουν εύκολα μεταγωγή.
Τρίτο βήμα:Απομόνωση των επιθυμητών βακτηρίων σας
Τρίτον, πρέπει να διαχωρίσετε τα βακτήρια που έχουν το πλασμίδιο σας από αυτά που δεν έχουν. Εδώ παίζει το γονίδιο αντίστασης στα αντιβιοτικά στον φορέα κλωνοποίησης. Συνήθως, η υγρή βακτηριακή καλλιέργεια απλώνεται σε ένα πιάτο που περιέχει ένα αντιβιοτικό και θρεπτικά συστατικά. Αυτό επιτρέπει στα βακτήρια που έχουν το πλασμίδιο σας να επιβιώσουν και να αναπτυχθούν, ενώ αυτά χωρίς το πλασμίδιο δεν θα επιβιώσουν.
Τέταρτο Βήμα:Συγκομιδή της αλληλουχίας DNA σας
Τέταρτον, πρέπει να μεγαλώσετε τα ανθεκτικά βακτήρια σας και να συλλέξετε τα πλασμίδια τους. Μια μέθοδος περιλαμβάνει τη χρήση ενός άκρου πιπέτας για να σπρώξετε μια βακτηριακή αποικία στο αντιβιοτικό σας πιάτο, το οποίο θα πρέπει να έχει το πλασμίδιο σας, και να τοποθετήσετε το άκρο σε έναν θρεπτικό ζωμό. Αυτό αυξάνει τρομερά τον πληθυσμό των βακτηρίων με το πλασμίδιο σας, μετατρέποντας τον διαφανή ζωμό θολό. Στη συνέχεια, μπορείτε να λύσετε τα βακτήρια υπό αλκαλικές συνθήκες και να καθαρίσετε το πλασμίδιο σας μέσω φυγοκέντρησης και χρωματογραφίας στήλης. Αυτό συγκεντρώνει το επιθυμητό τμήμα σας εκτός από τα βακτήρια.
Εφαρμογές Μοριακής Κλωνοποίησης
Γενετική Τροποποίηση Φυτών
Μία από τις πιο σημαντικές εφαρμογές της μοριακής κλωνοποίησης αφορά την ανάπτυξη γενετικά τροποποιημένων οργανισμών στη γεωργία. Με τις εξελίξεις στη βιοτεχνολογία, η γεωργική βιομηχανία έχει επενδύσει σε μεγάλο βαθμό στη γενετική τροποποίηση των καλλιεργειών για τη βελτίωση της ποιότητας και την αύξηση της απόδοσης. Αυτές οι γενετικά τροποποιημένες καλλιέργειες έχουν συχνά γενετική αντοχή σε παράσιτα και ζιζανιοκτόνα που προορίζονται να σκοτώσουν τα ζιζάνια.
Για να τροποποιήσουν γενετικά τα φυτά, οι γεωπόνοι χρησιμοποιούν το βακτηριακό είδος Agrobacterium tumafaciens, γνωστό φυτικό παθογόνο. Στη φύση, A. tumafaciens εμφυτεύει το πλασμίδιο του στον φυτικό ιστό, ο οποίος προκαλεί το σχηματισμό όγκων, που προκαλούνται από την περιοχή Τ-DNA του πλασμιδίου. Χρησιμοποιώντας μοριακή κλωνοποίηση, οι επιστήμονες μπορούν να κατασκευάσουν και να ενισχύσουν εκδόσεις αυτού του πλασμιδίου όπου η περιοχή Τ-DNA αντικαθίσταται με διαφορετικά γονίδια. Αυτό παρέχει στη συνέχεια γονίδια που είναι πλεονεκτικά για τη γεωργική βιομηχανία έναν τρόπο στον φυτικό ιστό.
Παραγωγή πρωτεϊνών
Μια άλλη σημαντική εφαρμογή της μοριακής κλωνοποίησης περιλαμβάνει τη μαζική παραγωγή πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται σε φαρμακευτικά φάρμακα. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η αλληλουχία που εμφυτεύεται στον φορέα κλωνοποίησης περιλαμβάνει ένα γονίδιο για μια πρωτεΐνη με κάποια θεραπευτική αξία. Όταν μετατρέπεται σε βακτήρια, ο μοριακός μηχανισμός των βακτηρίων μεταγράφει και μεταφράζει το γονίδιο, συνθέτοντας την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Όταν κλωνοποιηθεί σε πολλές γενιές, μπορούν να παραχθούν μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης.
Η ινσουλίνη, ένα κρίσιμο φάρμακο για τα άτομα με διαβήτη, είναι μια τέτοια πρωτεΐνη που μπορούν να δημιουργήσουν οι επιστήμονες χρησιμοποιώντας μοριακή κλωνοποίηση.
