PCR:Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης

Βασικές έννοιες

Σε αυτό το άρθρο, μαθαίνουμε τα πάντα για την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, πιο γνωστή ως PCR, συμπεριλαμβανομένου του ιστορικού, των λεπτομερών μηχανισμών και της πρακτικής χρήσης της.

Μελέτη DNA

Από τότε που οι βιολόγοι άρχισαν να συνειδητοποιούν τη σημασία του DNA, οι τεχνικές απομόνωσης και αντιγραφής αλληλουχιών DNA ήταν κρίσιμες στη βιολογική έρευνα. Συγκεκριμένα, τέτοιες τεχνικές χρειάζονται για τη δημιουργία υψηλών συγκεντρώσεων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA, το οποίο οι επιστήμονες μπορούν να αναλύσουν μέσω απορρόφησης φωτός, ηλεκτροφόρησης γέλης και άλλων μεθόδων.

Για δεκαετίες, η κύρια μέθοδος ενίσχυσης τμημάτων DNA περιλάμβανε μια διαδικασία που οι βιοχημικοί ονομάζουν μοριακή κλωνοποίηση. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος απαιτούσε συχνά ημέρες, αν όχι εβδομάδες, για να δώσει ένα συμπυκνωμένο δείγμα DNA. Έτσι, η ζήτηση μεταξύ των επιστημόνων παρέμεινε υψηλή για την ανάπτυξη μιας νέας τεχνικής. Εδώ παίζει ρόλο η PCR ή η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης.

Αυτό που κάποτε ήταν μια αργή και δαπανηρή διαδικασία έγινε γρήγορα αποτελεσματική, απλή και αξιόπιστη. Με την PCR, οι επιστήμονες ανέπτυξαν πολλές νέες εφαρμογές που περιλαμβάνουν DNA, όπως δακτυλικά αποτυπώματα DNA, τεστ πατρότητας και δοκιμές ιογενών λοιμώξεων.

Λόγω της σημασίας του σήμερα, παραμένει πολύτιμο να αναρωτηθούμε:τι ακριβώς είναι η PCR; Για να κατανοήσουμε πώς η PCR έφερε επανάσταση στην επιστήμη, πρέπει να ρίξουμε μια πιο προσεκτική ματιά.

Τι είναι η PCR;

Όπως η μοριακή κλωνοποίηση, η PCR απαιτεί δύο σημαντικά συστατικά:

• Εκκινητές DNA
• Taq DNA Polymerase

Σε αντίθεση με τη μοριακή κλωνοποίηση, ωστόσο, η PCR δεν απαιτεί βακτηριακό στέλεχος ή ζωντανό οργανισμό. Αντίθετα, το DNA ενισχύεται με καθαρά χημικά μέσα.

Είναι σημαντικό ότι πρέπει να γνωρίζετε κάποιες πληροφορίες σχετικά με την ακολουθία που θέλετε να αναπαραγάγετε. Πρέπει να γνωρίζετε ένα μικρό τμήμα βάσεων αμέσως πριν και μετά την επιθυμητή ακολουθία. Για να λειτουργήσει η PCR, πρέπει να δημιουργήσετε σύντομες αλληλουχίες μονόκλωνου DNA (ssDNA) που αντιστοιχούν σε αυτές τις εκτάσεις. Οι βιοχημικοί ονομάζουν αυτά τα τεντώματα "εκκινητές" και χρειάζεστε δύο από αυτούς:ένα που ζευγαρώνει βάσεις με το DNA πριν από την επιθυμητή αλληλουχία σας και ένα που ζευγαρώνει βάσεις με το συμπληρωματικό DNA μετά την επιθυμητή αλληλουχία. Έτσι, ο δεύτερος εκκινητής σας συνδέεται με το DNA μετά την επιθυμητή αλληλουχία στον άλλο κλώνο.

Μαζί με τους εκκινητές DNA σας, χρειάζεστε επίσης ένα ειδικό ένζυμο που ονομάζεται Taq DNA Polymerase. Όλοι οι οργανισμοί έχουν κάποια μορφή DNA πολυμεράσης, η οποία συναρμολογεί κλώνους DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές. Ωστόσο, η Taq DNA Polymerase έχει μια μοναδική προέλευση:ένα είδος μικροβίου που ζει στις ηφαιστειακές περιοχές του Yellowstone. Κατά συνέπεια, αυτή η μορφή DNA πολυμεράσης είναι μοναδικά προσαρμοσμένη για να λειτουργεί σε υψηλές θερμοκρασίες, γεγονός που επιτρέπει ταχύτερο πολυμερισμό. Επιπλέον, σε αντίθεση με τις περισσότερες πολυμεράσες DNA, η ποικιλία Taq δεν μετουσιώνεται σε υψηλές θερμοκρασίες.

Μόλις έχετε και τους εκκινητές DNA και την Taq DNA Polymerase, μαζί με την επιθυμητή αλληλουχία σας σε ένα διάλυμα τριφωσφορικών ελεύθερων νουκλεοτιδίων, μπορεί να συμβεί PCR. Το μείγμα της αντίδρασής σας πρέπει να περάσει από τρεις διακριτές φάσεις θερμοκρασίας και αυτός ο κύκλος επαναλαμβάνεται πολλές φορές για να ενισχυθεί πλήρως η αλληλουχία σας.

PCR Φάση 1:Μετουσίωσης

Στην πρώτη φάση, η θερμοκρασία του μείγματος της αντίδρασής σας αυξάνεται αρκετά ψηλά ώστε το DNA σας με την επιθυμητή αλληλουχία να «μετουσιωθεί» ή να «λιώσει». Αυτό σημαίνει απλώς ότι τα δύο σκέλη χωρίζονται. Σημειώστε ότι σε αυτό το στάδιο, η επιθυμητή αλληλουχία είναι ενσωματωμένη σε μια πολύ μεγαλύτερη αλυσίδα DNA. Αυτό θα μπορούσε να είναι τόσο μεγάλο όσο ένα ολόκληρο χρωμόσωμα, αλλά είναι πολύ πιο συνηθισμένο να είναι βακτηριακό πλασμίδιο.

PCR Φάση 2:Ανόπτηση

Στη δεύτερη φάση, η θερμοκρασία πέφτει στο μείγμα της αντίδρασής σας για να συμβεί "ανόπτηση". Αυτό περιλαμβάνει τη σύνδεση των εκκινητών DNA σας στις αντίστοιχες αλληλουχίες τους. Δεδομένου ότι οι εκκινητές είναι πολύ μικρότεροι από τους κλώνους, οι μακρύτεροι κλώνοι συνδέονται πολύ πιο γρήγορα με τους εκκινητές παρά με τον εαυτό τους.

PCR Φάση 3:Επέκταση

Στην τρίτη φάση, η θερμοκρασία αυξάνεται αργά, γεγονός που επιτρέπει στην Taq DNA Polymerase να συνδεθεί με τους εκκινητές. Στη συνέχεια, το ένζυμο στρατολογεί ελεύθερα αιωρούμενα τριφωσφορικά νουκλεοτίδια, ζευγαρώνοντας βάσεις με τον συμπληρωματικό κλώνο DNA, επεκτείνοντας τον εκκινητή κατά μήκος του κλώνου. Δεδομένου ότι όλες οι πολυμεράσες DNA μπορούν να πραγματοποιήσουν αντιγραφή DNA μόνο στην κατεύθυνση 5' προς 3', το αναδιπλασιασμένο DNA περιλαμβάνει πάντα είτε την ίδια την επιθυμητή αλληλουχία είτε το συμπλήρωμά της. Ανά διπλή έλικα μητρικού DNA, αυτό το βήμα σχηματίζει δύο μονούς κλώνους ελαφρώς μικρότερου DNA που ξεκινούν από έναν εκκινητή.

PCR Φάση 4:Επαναλάβετε

Αυτές οι ίδιες τρεις φάσεις θερμοκρασίας επαναλαμβάνονται δεκάδες έως εκατοντάδες φορές για να ενισχύσουν την επιθυμητή ακολουθία. Μόλις ξεκινήσει ο δεύτερος κύκλος, το ελαφρώς μικρότερο DNA που σχηματίστηκε στον προηγούμενο κύκλο θα συνδεθεί με τον αντίθετο εκκινητή που το παρήγαγε. Μόλις αντιγραφεί από την Πολυμεράση, η προκύπτουσα αλυσίδα περιλαμβάνει την επιθυμητή αλληλουχία (ή το συμπλήρωμά της) και τις σύντομες αλληλουχίες που αντιστοιχούν στους εκκινητές σας.

Σε μεταγενέστερους κύκλους, όλες οι επακόλουθες δεσμεύσεις εκκινητών σε αυτή τη σύντομη αλληλουχία αποδίδουν περαιτέρω εκτάσεις του ίδιου μήκους, είτε με την ίδια αλληλουχία είτε με το συμπλήρωμά της. Φυσικά, περαιτέρω αντιγραφή λαμβάνει χώρα επίσης στο αρχικό γονικό σας DNA, αλλά κατά τη διάρκεια πολλαπλών κύκλων, η ποσότητα του DNA με την επιθυμητή αλληλουχία σας είναι νάνος εκείνης οποιουδήποτε άλλου DNA. Με αυτό, έχετε ενισχύσει με επιτυχία την επιθυμητή ακολουθία και δημιουργήσατε ένα συμπυκνωμένο διάλυμα.

Εφαρμογές της PCR

Η πραγματική χρησιμότητα της PCR στην καθημερινή ζωή προέρχεται από την ικανότητά της να αναγνωρίζει την παρουσία ορισμένων αλληλουχιών DNA. Εάν θέλετε να ελέγξετε εάν ένα δεδομένο δείγμα έχει μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA, μπορείτε να σχεδιάσετε εκκινητές που αντιστοιχούν σε τμήματα αυτής της επιθυμητής αλληλουχίας. Στη συνέχεια, όταν εκτελείτε PCR σε αυτό το δείγμα, η μόνη αντιγραφή DNA που συμβαίνει πρέπει να περιλαμβάνει την επιθυμητή αλληλουχία. Αυτό συμβαίνει επειδή η Taq DNA Polymerase μπορεί να συνθέσει κλώνους DNA μόνο από εκκινητές συνδεδεμένους σε κλώνο μήτρας.

Αυτό μπορεί να φαίνεται αφηρημένο, αλλά φανταστείτε ότι γνωρίζετε την αλληλουχία DNA κάποιου ιικού παθογόνου. μπορείτε να σχεδιάσετε εκκινητές για επιλεκτικό ζεύγος βάσεων με αυτό το DNA. Ή φανταστείτε ότι έχετε δείγμα αίματος από έναν τόπο εγκλήματος με έναν πιθανό ύποπτο. μπορείτε να σχεδιάσετε εκκινητές που συνδέονται επιλεκτικά με μοναδικές αλληλουχίες (που ονομάζονται σύντομες διαδοχικές επαναλήψεις) από το DNA του υπόπτου σας. Εναλλακτικά, θα μπορούσατε να εκτελέσετε μια παρόμοια διαδικασία για τον προσδιορισμό της καταγωγής στο πλαίσιο ενός τεστ πατρότητας.

Ηλεκτροφόρηση γέλης

Αλλά πώς ξέρουμε αν έχει συμβεί αντιγραφή στο DNA που μας ενδιαφέρει; Για να αναλύσουμε την τελική μας αντίδραση PCR, φορτώνουμε τα δείγματα σε γέλη αγαρόζης και πραγματοποιούμε ηλεκτροφόρηση γέλης. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει την τοποθέτηση της γέλης σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα με δύο μεγάλα ηλεκτρόδια σε κάθε άκρο. Στην κορυφή, κοντά στα φρεάτια μας με το δείγμα μας, υπάρχει ένα αρνητικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο (ή άνοδος) και απέναντι υπάρχει ένα θετικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο (ή κάθοδος).

Μόλις φορτώσετε τα δείγματά σας και ενεργοποιήσετε τα ηλεκτρόδιά σας, το DNA σας θα αρχίσει να κινείται προς την κάθοδο. Αυτό συμβαίνει επειδή το DNA έχει αρνητικό φορτίο στα περισσότερα επίπεδα pH λόγω του φωσφορικού σκελετού του. Είναι σημαντικό ότι μικρότερα θραύσματα DNA κινούνται γρηγορότερα μέσω της γέλης από τα μεγάλα θραύσματα. Μετά από λίγα λεπτά (λιγότερα από 20), τυχόν μικρά θραύσματα θα έχουν μετακινηθεί σημαντικά μέσα από το φρεάτιο, ενώ οι μητρικοί κλώνοι παραμένουν βασικά στην ίδια θέση. Όταν απεικονίζεται κάτω από το υπεριώδες φως, μπορείτε να δείτε οπτικά τη ζώνη οποιωνδήποτε μικρών θραυσμάτων του επιθυμητού DNA.