Πώς το σαπούνι αλατιού και το εκχύλισμα αιθανόλης DNA;
1. Λύση κυττάρων:
- Συγκεντρώστε τα υλικά σας που περιλαμβάνουν ένα δείγμα κυττάρων (φυτού ή ζωικού ιστού), αλατιού, σαπούνι υγρού πλύσης πιάτων και ρυθμιστικό εκχύλισης DNA (ρυθμιστικό διάλυμα TE ή ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA).
- Τοποθετήστε ένα μικρό κομμάτι του δείγματος ιστού σε κονίαμα και γουδοχέρι ή ένα μικρό δοχείο με καπάκι.
- Προσθέστε μια μικρή ποσότητα αλατιού στο δείγμα (περίπου 1/4 κουταλάκι του γλυκού ανά 1 γραμμάριο ιστού).
- Προσθέστε μερικές σταγόνες υγρού σαπουνιού πλυσίματος πιάτων στο μείγμα και αλέστε ή ψήστε τον ιστό καλά.
- Αυτό το βήμα ανοίγει τις κυτταρικές μεμβράνες, απελευθερώνοντας το DNA.
2. Κατοίκηση πρωτεΐνης:
- Μεταφέρετε το προϊόν λύσης (το μείγμα σπασμένων κυττάρων) σε σωλήνα φυγοκέντρησης.
- Προσθέστε έναν όγκο διαλύματος εκχύλισης ψυχρού DNA ίσο με τον όγκο του λύματος. Ανακατέψτε καλά.
- Το ρυθμιστικό εκχύλισης DNA περιέχει απορρυπαντικά που βοηθούν στη διάλυση των κυτταρικών μεμβρανών και των πρωτεϊνών, καθώς και ένα διάλυμα άλατος που βοηθά στην καθίζηση των πρωτεϊνών (συμπεριλαμβανομένων των ιστόνων που σχετίζονται με το DNA) από το διάλυμα.
- Οι πρωτεΐνες σχηματίζουν μια συσσωμάτωση και ξεχωριστά από το DNA.
3. Κατοικίες DNA:
- Φυγοκεντρήστε το μείγμα για λίγα λεπτά σε υψηλή ταχύτητα (περίπου 12.000-15.000 σ.α.λ.).
- Αυτό θα προκαλέσει τις κατακρημνισμένες πρωτεΐνες και τα κυτταρικά συντρίμμια να σχηματίσουν ένα σφαιρίδιο στο κάτω μέρος του σωλήνα, αφήνοντας το DNA στο υπερκείμενο (το υγρό πάνω από το σφαιρίδιο).
4. Συλλογή DNA:
- Αφαιρέστε προσεκτικά το υπερκείμενο, το οποίο περιέχει το DNA, σε ένα νέο σωλήνα.
- Αποφύγετε τη μεταφορά οποιουδήποτε από τα σφαιρίδια, καθώς περιέχει κυρίως πρωτεΐνες και κυτταρικά συντρίμμια.
- Το DNA είναι τώρα σε σχετικά καθαρή μορφή, απαλλαγμένο από τα περισσότερα κυτταρικά συστατικά και πρωτεΐνες.
Εξαγωγή αιθανόλης:
1. Κατοικίες DNA:
- Στον σωλήνα που περιέχει το διάλυμα DNA από την εξαγωγή σαπουνιού αλατιού, προσθέστε ίσο όγκο ψυχρού 95% -100% αιθανόλη.
- Ανακατέψτε απαλά με την αναστροφή του σωλήνα αρκετές φορές. Μην στροβιλίζετε, καθώς αυτό μπορεί να διατρίψει το DNA.
- Το DNA θα αρχίσει να βγει από το διάλυμα ως λευκή, χρωστική μάζα.
2. Πλύσιμο DNA:
- Φυγοκεντρήστε το μείγμα για λίγα λεπτά σε υψηλή ταχύτητα (περίπου 12.000-15.000 σ.α.λ.).
- Το DNA θα σχηματίσει ένα σφαιρίδιο στο κάτω μέρος του σωλήνα. Αφαιρέστε προσεκτικά το υπερκείμενο (το διάλυμα αιθανόλης) χωρίς να διαταράξετε το σφαιρίδιο.
3. ξήρανση DNA:
- Ξεπλύνετε απαλά το σφαιρίδιο DNA με κρύο 70% αιθανόλη για να αφαιρέσετε τυχόν υπολειμματικά άλατα.
- Φυγοκεντρήστε σύντομα για να συλλέξετε το DNA στο κάτω μέρος του σωλήνα.
- Αφαιρέστε προσεκτικά την αιθανόλη χωρίς να διαταράξετε το σφαιρίδιο.
- Αφήστε το σφαιρίδιο DNA να στεγνώσει για λίγα λεπτά.
4.
- Προσθέστε μια μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης DNA (ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ ή Tris-EDTA) στο σωλήνα που περιέχει το σφαιρίδιο DNA.
- Χρησιμοποιήστε μια μικροπιπέτα για να δοκιμάσετε απαλά το DNA με πιπέρι πάνω και προς τα κάτω μέχρι να διαλυθεί πλήρως.
- Το DNA είναι έτοιμο για περαιτέρω ανάλυση, όπως PCR, ηλεκτροφόρηση πηκτής ή άλλες τεχνικές μοριακής βιολογίας.
Και οι δύο μέθοδοι στοχεύουν να διαταράξουν την κυτταρική μεμβράνη, να απελευθερώσουν το DNA και στη συνέχεια να διαχωρίσουν το DNA από άλλα κυτταρικά συστατικά μέσω βροχοπτώσεων και φυγοκέντρησης. Παρέχουν έναν απλό και οικονομικό τρόπο για την εξαγωγή DNA για βασικά πειράματα και εκπαιδευτικούς σκοπούς.
