Ειδικές λειτουργίες κάθε χημικών ουσιών που χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση DNA;

Χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση DNA:

1. Buffer λύσης:

* Λειτουργία: Σπάει ανοιχτά κύτταρα και απελευθερώνει το DNA.

* Στοιχεία:

* απορρυπαντικό: Διαταράσσει τις κυτταρικές μεμβράνες (π.χ. SDS, Triton Χ-100).

* αλάτι: Βοηθά στην εξουδετέρωση των φορτισμένων μορίων και σταθεροποιεί το DNA (π.χ. NaCl).

* buffer tris: Διατηρεί το PH για τη βέλτιστη δραστικότητα ενζύμου.

* EDTA: Χηλικός παράγοντας που δεσμεύεται σε δισθενούς κατιόντες όπως το μαγνήσιο, αποτρέποντας την αποικοδόμηση του DNA από DNases.

2. Πρωτεϊνάση Κ:

* Λειτουργία: Οι πρωτεΐνες αφομοιών, συμπεριλαμβανομένων των ιστόνων που συνδέονται με το DNA.

* Μηχανισμός: Μια πρωτεάση σερίνης που διασπά τους πεπτιδικούς δεσμούς εντός πρωτεϊνών.

* Σκοπός: Αφαιρεί τις πρωτεΐνες που μπορούν να παρεμβαίνουν στην απομόνωση και τον καθαρισμό του DNA.

3. Φαινόλη/χλωροφόρμιο:

* Λειτουργία: Διαχωρίζει το DNA από πρωτεΐνες και άλλα κυτταρικά συντρίμμια.

* Μηχανισμός: Η φαινόλη μετουσιώνει τις πρωτεΐνες και τις καθιστά αδιάλυτες, ενώ το χλωροφόρμιο δρα ως μετουσίωση και βοηθά στον διαχωρισμό των υδατικών και οργανικών φάσεων.

* Διαδικασία: Μετά από έντονη ανάδευση, το μείγμα χωρίζεται σε τρία στρώματα:

* Κορυφαία στρώμα:υδατική φάση που περιέχει DNA.

* Μεσαία στρώση:Η ενδιάμεση φάση που περιέχει μετουσιωμένες πρωτεΐνες.

* Στρώμα κάτω:Οργανική φάση που περιέχει φαινόλη/χλωροφόρμιο.

* Το DNA ανακτάται από το υδατικό στρώμα.

4. Αιθανόλη/ισοπροπανόλη:

* Λειτουργία: Κατακρημνίζει DNA από διάλυμα.

* Μηχανισμός: Το DNA είναι διαλυτό σε νερό αλλά αδιάλυτο σε αιθανόλη ή ισοπροπανόλη. Όταν προστίθενται, αυτές οι αλκοόλες μειώνουν τη διαλυτότητα του DNA, προκαλώντας την καθίζηση του διαλύματος.

* Διαδικασία: Μετά την προσθήκη αιθανόλης ή ισοπροπανόλης, το μείγμα φυγοκεντρείται για να συλλέξει το σφαιρίδιο DNA.

5. Buffer TE:

* Λειτουργία: Επανατοποθετεί και αποθηκεύει το DNA μετά την εκχύλιση.

* Στοιχεία:

* buffer tris: Διατηρεί το PH για τη βέλτιστη σταθερότητα του DNA.

* EDTA: Χηλικός παράγοντας που αναστέλλει τις DNases.

* Σκοπός: Εξασφαλίζει ότι το DNA παραμένει άθικτο και προστατευμένο από την υποβάθμιση κατά την αποθήκευση.

6. RNase A:

* Λειτουργία: Αφαιρεί τη μόλυνση του RNA.

* Μηχανισμός: Ένα ένζυμο που υποβαθμίζει ειδικά το RNA.

* Σκοπός: Εξασφαλίζει ένα καθαρό δείγμα DNA για εφαρμογές κατάντη όπως PCR ή αλληλουχία.

Σημείωση: Ορισμένα πρωτόκολλα μπορούν να χρησιμοποιούν άλλες χημικές ουσίες όπως η υδροχλωρική γουανιδίνη ή η θειοκυανική γουανιδίνη για λύση ή στήλες διοξειδίου του πυριτίου για δέσμευση και καθαρισμό DNA αντί για φαινόλη/χλωροφόρμιο.