Επεξήγηση HPLC:Αρχές, Εφαρμογές &Τεχνικές

Βασικές έννοιες

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική στην αναλυτική χημεία για τον διαχωρισμό, την αναγνώριση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεμονωμένων ενώσεων σε ένα μείγμα χημικών ουσιών. Έχει ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών, από φαρμακευτικά, εγκληματολογικά, περιβαλλοντικά εργαστήρια και άλλα!

Θέματα που καλύπτονται σε άλλα άρθρα

• Τι είναι η χρωματογραφία;
• Πολικοί δεσμοί έναντι μη πολικών δεσμών
• Διαμοριακές δυνάμεις

Αρχές Χρωματογραφίας

Αφού λάβει χώρα μια χημική αντίδραση, το προϊόν συνήθως αποτελείται από ένα μείγμα ενώσεων:το επιθυμητό προϊόν (ονομάζεται επίσης αναλύτης ) , σε συνδυασμό με άλλα παραπροϊόντα, ακαθαρσίες κ.λπ. (ονομάζεται επίσης μήτρα ). Για τον διαχωρισμό του μίγματος, μπορεί να χρησιμοποιηθεί χρωματογραφία. Η χρωματογραφία διαχωρίζει ένα μείγμα με βάση τις διαφορές στην πολικότητα και χρησιμοποιεί δύο διαφορετικά μέρη. Η στάσιμη φάση είναι ένα μη κινούμενο συστατικό - σε HPLC, αυτή είναι συνήθως μια στήλη γεμάτη με μικρά σωματίδια πυριτίου ή πολυμερούς. Η φάση για κινητά είναι συνήθως κάποιο είδος διαλύτη και περνά μέσα από τη στήλη, ωθώντας προς τα έξω το δείγμα. Οι διαφορετικές ενώσεις στο μείγμα παρουσιάζουν διαφορετικές έλξεις στη στατική φάση και στην κινητή φάση λόγω διαφορών στην πολικότητα. (Οι μη πολικές ενώσεις προσελκύουν μη πολικές ενώσεις και οι πολικές ενώσεις προσελκύουν πολικές ενώσεις!) Έτσι, οι ενώσεις του μείγματος θα ωθηθούν προς τα έξω (εκλούονται ) σε διαφορετικές τιμές.

Στοιχεία ενός συστήματος HPLC

1. Αντλία διαλυτών :η αντλία ωθεί τον διαλύτη (κινητή φάση) μέσω του συστήματος σε εξαιρετικά υψηλή πίεση. Λόγω αυτής της υψηλής πίεσης, η HPLC είναι πολύ πιο γρήγορη από άλλες μεθόδους χρωματογραφίας, όπως η χρωματογραφία στήλης!
2. Αυτόματη δειγματοληψία :ο αυτόματος δειγματολήπτης εξάγει το δείγμα στη ροή του συστήματος
3. Στήλη: οι διάφορες χημικές ουσίες στο δείγμα διαχωρίζονται εδώ, καθώς κινούνται μέσω της στήλης (στάσιμη φάση) με διαφορετικούς ρυθμούς
4. Ανιχνευτές: διαφορετικά συστήματα HPLC μπορούν να χρησιμοποιούν διάφορους ανιχνευτές. Οι κοινοί ανιχνευτές περιλαμβάνουν το UV-Vis, τα φασματόμετρα μάζας, την αγωγιμότητα, τον δείκτη διάθλασης κ.λπ. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι ανιχνευτών:ειδικοί (ανίχνευση ιδιοτήτων της συγκεκριμένης ένωσης στο δείγμα) και χύμα (ανίχνευση ιδιοτήτων με βάση τις συγκεκριμένες ενώσεις στο δείγμα και τους διαλύτες στην κινητή φάση).
5. Σύστημα δεδομένων χρωματογραφίας (CDS) :ένας υπολογιστής μεταφράζει τα σήματα του ανιχνευτή σε χρωματογραφήματα που μπορούν να ερμηνεύσουν οι επιστήμονες

Απλοποιημένο μοντέλο συστήματος HPLC

Παραλλαγές HPLC

1. Χρωματογραφία κανονικής φάσης :Η στήλη (στάσιμη φάση) είναι γεμάτη με πολικά σωματίδια, συνήθως πυρίτιο. Ο διαλύτης (κινητή φάση) είναι ένας σχετικά μη πολικός διαλύτης. Έτσι, οι μη πολικές ενώσεις θα εκλούονται πρώτα λόγω της υψηλότερης συγγένειάς τους προς την κινητή φάση.
2. Χρωματογραφία ανάστροφης φάσης: Η στήλη (στάσιμη φάση) είναι γεμάτη με μη πολικά σωματίδια, όπως μια στήλη C18 (πυριτία με συνδεδεμένη μια εξαιρετικά μη πολική αλυσίδα 18 άνθρακα). Ο διαλύτης (κινητή φάση) είναι ένας σχετικά πολικός διαλύτης. Εφόσον το πολικό έλκει το πολικό, οι πολικές ενώσεις θα εκλούονται πρώτα, αντίθετα από τη χρωματογραφία κανονικής φάσης! Αυτός είναι ο πιο κοινός τύπος HPLC που χρησιμοποιείται σε εργαστήρια σε όλο τον κόσμο.
3. Χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων: Η στήλη (στάσιμη φάση) γεμίζει με σωματίδια με φορτίο αντίθετο από αυτό του επιθυμητού προϊόντος. Το δείγμα διέρχεται και εφόσον έλκονται αντίθετα φορτία, το επιθυμητό προϊόν παγιδεύεται στη στήλη ενώ τα υποπροϊόντα ξεπλένονται. Η ένωση μπορεί να απελευθερωθεί αυξάνοντας την ιοντική ισχύ του ρυθμιστικού ή αλλάζοντας το pH.
4. Χρωματογραφία εξαίρεσης μεγέθους: Αντί για πολικότητα, η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους διαχωρίζει τα μόρια με βάση το μέγεθός τους περνώντας το δείγμα μέσα από ένα πήκτωμα με διάφορους πόρους. Μόρια μικρότερα από αυτούς τους πόρους θα παγιδευτούν, ενώ μεγαλύτερα μόρια θα εκλούονται πρώτα.

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της HPLC

Με πολλές διαφορετικές μεθόδους χρωματογραφίας που είναι διαθέσιμες στον τυπικό επιστήμονα, γιατί χρησιμοποιείται τόσο συχνά η HPLC; Ο πρώτος λόγος είναι επειδή η HPLC τείνει να είναι εξαιρετικά αυτοματοποιημένη, γεγονός που οδηγεί σε καλή ακρίβεια και μειώνει την πιθανότητα ανθρώπινου λάθους. Αυτό οδηγεί σε πειράματα που γίνονται με HPLC που αναπαράγονται εύκολα, κάτι που είναι κρίσιμο στην Επιστημονική Μέθοδο! Επιπλέον, η υψηλή πίεση που χρησιμοποιείται από την αντλία διαλύτη, σε συνδυασμό με την απόδοση του μηχανήματος, οδηγεί στην ταχύτερη ολοκλήρωση των πειραμάτων. Επιπλέον, η HPLC είναι εξαιρετικά ευαίσθητη. Ως εκ τούτου, είναι σε θέση να ανιχνεύσει ίχνη ακαθαρσιών και υποπροϊόντων που μπορεί να χάνουν άλλες μέθοδοι.

Ωστόσο, η HPLC μπορεί να είναι πιο ακριβή από άλλες μεθόδους για τις μηχανές που πρόκειται να εγκατασταθούν και να συντηρηθούν. Ένα άλλο κόστος λειτουργίας της HPLC είναι οι μεγάλες ποσότητες διαλύτη που καταναλώνουν οι μηχανές. Η ανάπτυξη νέων μεθόδων ή η αντιμετώπιση σφαλμάτων τείνει επίσης να είναι πιο περίπλοκη από άλλες μεθόδους, απαιτώντας επιστήμονες με προηγμένη ή εξειδικευμένη κατάρτιση. Επίσης, τα δείγματα πρέπει να προετοιμάζονται εξαιρετικά προσεκτικά, καθώς η εγκυρότητα μιας μεθόδου HPLC εξαρτάται από την ακρίβεια και την καθαρότητα του δείγματος, την κινητή φάση και τη λειτουργία του συστήματος. Τέλος, η ανάλυση των δεδομένων που δημιουργούνται από το σύστημα δεδομένων χρωματογραφίας (CDS) ενδέχεται να απαιτεί εξειδικευμένο λογισμικό.

Περαιτέρω ανάγνωση

• Φασματομετρία μάζας και φασματόμετρα μάζας
• Χρωματογραφία λεπτής στρώσης
• Πώς να διαβάσετε ένα χρωματογράφημα;
• Χρωματογραφία χαρτιού και TLC