Διαφορά μεταξύ του διανύσματος κλωνοποίησης και του διανύσματος έκφρασης

Κύρια διαφορά – Κλωνοποίηση διάνυσμα έναντι διανύσματος έκφρασης

Ο φορέας κλωνοποίησης και ο φορέας έκφρασης είναι δύο τύποι φορέων, που χρησιμοποιούνται στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA για τη μεταφορά ξένων τμημάτων DNA σε ένα κύτταρο στόχο. Τόσο οι φορείς κλωνοποίησης όσο και οι φορείς έκφρασης περιλαμβάνουν την αρχή της αντιγραφής, μοναδικές θέσεις περιορισμού και επιλέξιμο γονίδιο δείκτη στις αλληλουχίες φορέων τους. Τόσο οι φορείς κλωνοποίησης όσο και οι φορείς έκφρασης είναι αυτοαναπαραγόμενοι λόγω της παρουσίας μιας αρχής αντιγραφής. Οι φορείς κλωνοποίησης μπορεί να είναι είτε πλασμίδια, κοσμίδια ή βακτηριοφάγοι. Η κύρια διαφορά μεταξύ του φορέα κλωνοποίησης και του φορέα έκφρασης είναι ότι ο φορέας κλωνοποίησης χρησιμοποιείται για τη μεταφορά ξένων τμημάτων DNA σε ένα κύτταρο ξενιστή, ενώ ο φορέας έκφρασης είναι ένας τύπος φορέα κλωνοποίησης, ο οποίος περιέχει κατάλληλα σήματα έκφρασης με μέγιστη έκφραση γονιδίου.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι ένας φορέας κλωνοποίησης
      – Ορισμός, τύποι, χρήσεις
2. Τι είναι ένα διάνυσμα έκφρασης
      – Ορισμός, τύποι, χρήσεις
3. Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ του Διανύσματος κλωνοποίησης και του Διανύσματος έκφρασης
      – Περίληψη κοινών χαρακτηριστικών
4. Ποιες είναι οι διαφορές μεταξύ του διανύσματος κλωνοποίησης και του διανύσματος έκφρασης
      – Σύγκριση βασικών διαφορών

Βασικοί όροι:βακτηριοφάγοι, φορέας κλωνοποίησης, κοσμίδια,  DNA, τεχνολογία DNA, δομή έκφρασης, φορέας έκφρασης, προέλευση αντιγραφής, περιοχή υποκινητή, ανασυνδυασμένο  RNA, πλασμίδια, περιορισμός τοποθεσίες, Επιλέξιμος δείκτης

Τι είναι ένας φορέας κλωνοποίησης

Οι φορείς κλωνοποίησης χρησιμεύουν ως μόρια DNA-φορείς. Όλοι οι φορείς κλωνοποίησης έχουν τέσσερα ειδικά χαρακτηριστικά: 

• Είναι αυτοαναπαραγόμενα μαζί με το ξένο τμήμα DNA που φέρουν
• Περιέχουν πολλές τοποθεσίες περιορισμού, οι οποίες υπάρχουν μόνο μία φορά στο διάνυσμα
• Φέρουν έναν επιλέξιμο δείκτη, συνήθως με τη μορφή γονιδίων ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά, τα οποία απουσιάζουν στο γονιδίωμα του ξενιστή
• Είναι σχετικά εύκολο να ανακτηθούν από το κύτταρο ξενιστή.

Υπάρχουν πολλές επιλογές κλασικών φορέων κλωνοποίησης όπως πλασμίδια, φάγοι και κοσμίδια ανάλογα με τον σκοπό. Η επιλογή ενός φορέα κλωνοποίησης εξαρτάται από το μέγεθος του ενθέτου και της εφαρμογής.

Πλασμίδια

Τα πλασμίδια είναι φυσικά, εξωχρωμοσωμικά, δίκλωνα μόρια DNA, τα οποία είναι ικανά να αναπαράγονται αυτόνομα μέσα στα βακτηριακά κύτταρα. Το όριο μεγέθους του ενθέματος στα πλασμίδια είναι 10 kb. Τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης σε υποκλωνοποίηση και μεταγενέστερο χειρισμό, κλωνοποίηση cDNA και προσδιορισμούς έκφρασης. Το pBR322 είναι ένα από τα πρώτα πλασμίδια που κατασκευάστηκαν γενετικά για να χρησιμοποιηθούν σε τεχνολογίες ανασυνδυασμένου DNA. Το πλασμίδιο pBR322 φαίνεται στο σχήμα 1 .

Εικόνα 1:pBR322

Φάγοι

Οι φάγοι προέρχονται από τον βακτηριοφάγο λάμδα στον οποίο το cos Η θέση του βακτηριοφάγου λάμδα επιτρέπει τη συσκευασία του σε κεφαλή φάγου. Η αντιγραφή του DNA του φορέα μέσα στο κύτταρο ξενιστή θα προκαλέσει τελικά τη λύση των κυττάρων. Το μέγεθος του ενθέματος που μπορεί να εισαχθεί σε έναν φορέα φάγου είναι 5-12 kb. Οι φορείς φάγων χρησιμοποιούνται στην κλωνοποίηση γονιδιωματικού DNA, στην κλωνοποίηση cDNA και σε βιβλιοθήκες έκφρασης.

Κοσμίδια

Τα κοσμίδια είναι ένα είδος πλασμιδίων που περιέχουν cos θέση του βακτηριοφάγου λάμδα. Το cos Η θέση του βακτηριοφάγου λάμδα επιτρέπει τη συσκευασία του σε κεφαλή φάγου. Αν και είναι ένα πλασμίδιο, η αντιγραφή των κοσμιδίων μέσα στο κύτταρο ξενιστή μπορεί να μην λύσει το κύτταρο όπως στους φορείς φάγου. Το μέγεθος του ενθέτου που μπορεί να κλωνοποιηθεί σε ένα κοσμιδιακό φορέα είναι 35-45 kb. Οι κοσμιδικοί φορείς χρησιμοποιούνται σε κατασκευές γονιδιωματικών βιβλιοθηκών.

Δεδομένου ότι τα γονίδια των θηλαστικών είναι συχνά μεγαλύτερα από 100 kb σε μέγεθος, η πλήρης γονιδιακή αλληλουχία δεν μπορεί να κλωνοποιηθεί με κλασικούς φορείς κλωνοποίησης. Αυτό το πρόβλημα παρακάμπτεται με τη μίμηση των ιδιοτήτων των χρωμοσωμάτων του κυττάρου ξενιστή σε φορείς. Αυτός ο τύπος φορέων ονομάζεται τεχνητοί χρωμοσωμικοί φορείς. Τα BAC (βακτηριδιακοί τεχνητοί χρωμοσωμικοί φορείς), οι YAC (τεχνητοί χρωμοσωμικοί φορείς ζύμης) και οι MAC (τεχνητοί χρωμοσωμικοί φορείς θηλαστικών) είναι τύποι τεχνητών χρωμοσωμάτων.

BAC

Οι βακτηριδιακοί τεχνητοί φορείς χρωμοσωμάτων βασίζονται στην Escherichia coli Πλασμίδιο παράγοντα F. Το μέγεθος του ενθέτου που μπορεί να κλωνοποιηθεί σε ένα φορέα BAC είναι 75-300 kb. Οι φορείς BAC χρησιμοποιούνται στην ανάλυση μεγάλων γονιδιωμάτων.

YAC

Οι φορείς τεχνητών χρωμοσωμάτων ζυμομύκητα βασίζονται σε Σακχαρομύκητες cerevisiae κεντρομερές, τελομερές και άλλες αυτόνομα αντιγραφόμενες αλληλουχίες. Το μέγεθος του ενθέτου που μπορεί να κλωνοποιηθεί σε ένα φορέα YAC είναι 100-1 Mb. Οι φορείς YAC χρησιμοποιούνται στην ανάλυση μεγάλων γονιδιωμάτων.

MAC

Οι τεχνητοί φορείς χρωμοσωμάτων θηλαστικών βασίζονται στο κεντρομερές, το τελομερές και την αρχή της αντιγραφής των θηλαστικών. Το μέγεθος ένθετου σε MAC είναι 100 kb έως 1 Mb. Τα MAC χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία των ζώων και στη γονιδιακή θεραπεία του ανθρώπου.

Τι είναι ένα διάνυσμα έκφρασης

Διανύσματα έκφρασης, που αναφέρονται επίσης ως κατασκευή έκφρασης , είναι ένας τύπος πλασμιδίων. Ένα ειδικό γονίδιο εισάγεται σε ένα κύτταρο ξενιστή με φορείς έκφρασης όπου η έκφραση του μετασχηματισμένου γονιδίου διευκολύνεται από τον φορέα έκφρασης με τη χρήση κυτταρικού-μεταγραφικού και μεταφραστικού μηχανισμού. Ένας φορέας έκφρασης περιλαμβάνει ρυθμιστικές αλληλουχίες όπως ενισχυτές και περιοχές προαγωγέα, οι οποίες οδηγούν σε μια αποτελεσματική γονιδιακή έκφραση. Μετά την έκφραση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης όπως η ινσουλίνη μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή, το προϊόν θα πρέπει να καθαριστεί από τις πρωτεΐνες του κυττάρου ξενιστή. Για το λόγο αυτό, η εισαγόμενη πρωτεΐνη είτε επισημαίνεται με ιστιδίνη (His tag) είτε με οποιαδήποτε άλλη πρωτεΐνη. Προκειμένου να επιτευχθεί αποτελεσματική έκφραση του εισαγόμενου γονιδίου μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή, τα ακόλουθα σήματα έκφρασης θα πρέπει να εισαχθούν σε έναν φορέα έκφρασης.

• Εισαγωγή ισχυρού υποκινητή.
• Εισαγωγή ισχυρού κωδικονίου τερματισμού.
• Σημαντική απόσταση μεταξύ της περιοχής προαγωγέα και του κλωνοποιημένου γονιδίου.
• Εισαγωγή μιας ακολουθίας έναρξης μεταγραφής.
• Εισαγωγή μιας ακολουθίας έναρξης μετάφρασης.

Εικόνα 2:pGEX-3X

Similarities Between Cloning Vector and Expression Vector

• Τόσο οι φορείς κλωνοποίησης όσο και οι φορείς έκφρασης χρησιμοποιούνται για την εισαγωγή ξένων τμημάτων DNA σε ένα κύτταρο στόχο γνωστό ως κύτταρο ξενιστή.

• Τόσο οι φορείς κλωνοποίησης όσο και οι φορείς έκφρασης μοιράζονται κοινά χαρακτηριστικά όπως η αρχή της αντιγραφής, μοναδικές θέσεις περιορισμού και επιλέξιμο γονίδιο δείκτη στην αλληλουχία φορέα τους.

• Τόσο οι φορείς κλωνοποίησης όσο και οι φορείς έκφρασης είναι ικανοί να αναπαράγονται ανεξάρτητα μέσα στο κύτταρο ξενιστή.

Διαφορά μεταξύ του διανύσματος κλωνοποίησης και του διανύσματος έκφρασης

Ορισμός

Διάνυσμα κλωνοποίησης: Ο φορέας κλωνοποίησης είναι ένα μικρό κομμάτι DNA που μπορεί να διατηρηθεί σταθερά μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή. Χρησιμοποιείται για την εισαγωγή γονιδίων στα κύτταρα ενώ λαμβάνονται πολυάριθμα αντίγραφα του ενθέτου.

Διάνυσμα έκφρασης: Ο φορέας έκφρασης είναι ένα πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για την εισαγωγή ενός συγκεκριμένου γονιδίου σε ένα κύτταρο-στόχο και τους μηχανισμούς του κυττάρου εντολέα για την παραγωγή του σχετικού προϊόντος γονιδίου.

Ρόλος

Διάνυσμα κλωνοποίησης: Οι φορείς κλωνοποίησης χρησιμοποιούνται για τη λήψη πολυάριθμων αντιγράφων του εισαγόμενου τμήματος DNA.

Διάνυσμα έκφρασης: Οι φορείς έκφρασης χρησιμοποιούνται για τη λήψη γονιδιακού προϊόντος του εισαγόμενου τμήματος DNA, είτε πρωτεΐνης είτε RNA.

Τύποι

Διάνυσμα κλωνοποίησης: Οι φορείς κλωνοποίησης μπορεί να είναι πλασμίδια, κοσμίδια, φάγοι, BAC, YAC ή MAC.

Διάνυσμα έκφρασης: Ο φορέας έκφρασης είναι ένας πλασμιδιακός φορέας.

Δυνατότητες του διανύσματος

Διάνυσμα κλωνοποίησης :Τα διανύσματα κλωνοποίησης περιλαμβάνουν μια αρχή αντιγραφής, μοναδικές θέσεις περιορισμού και έναν επιλέξιμο δείκτη.

Διάνυσμα έκφρασης: Ο φορέας έκφρασης περιλαμβάνει ενισχυτές, περιοχή προαγωγέα, κωδικόνιο τερματισμού, αλληλουχία έναρξης μεταγραφής και αλληλουχία έναρξης μετάφρασης στον φορέα επιπλέον των τυπικών χαρακτηριστικών ενός φορέα κλωνοποίησης.

Συμπέρασμα

Οι φορείς κλωνοποίησης και οι φορείς έκφρασης χρησιμοποιούνται εύκολα στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA για την εισαγωγή ξένων τμημάτων DNA στα κύτταρα-στόχους. Τόσο οι φορείς κλωνοποίησης όσο και οι φορείς έκφρασης είναι ικανοί να αναπαραχθούν μόνοι τους μέσα στο κύτταρο ξενιστή. Οι φορείς κλωνοποίησης χρησιμοποιούνται τυπικά για την εισαγωγή ξένων γονιδίων σε κύτταρα στόχους ενώ επιτυγχάνονται πολυάριθμα αντίγραφα του εισαγόμενου γονιδίου. Οι φορείς έκφρασης χρησιμοποιούνται για να ληφθεί το γονιδιακό προϊόν, είτε πρωτεΐνη είτε RNA του εισαγόμενου γονιδίου μέσα στο κύτταρο ξενιστή. Οι περισσότερες από τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες όπως η ινσουλίνη παράγονται με τη χρήση φορέων έκφρασης. Η κύρια διαφορά μεταξύ του φορέα κλωνοποίησης και του φορέα έκφρασης είναι η εφαρμογή κάθε φορέα στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA.

Αναφορά:

1. «Διανύσματα κλωνοποίησης». Κλωνοποίηση και Μοριακή Ανάλυση Γονιδίων. Ν.π., ν.δ. Ιστός. Διαθέσιμο εδώ. 18 Ιουνίου 2017. 
2. "Διανύσματα σαΐτας και διανύσματα έκφρασης." Απεριόριστος. Boundless, 26 Μαΐου 2016. Web. Διαθέσιμο εδώ. 18 Ιουνίου 2017. 

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "PBR322" Από Ayacop (+ Yikrazuul) – Δικό έργο (Δημόσιος Τομέας) μέσω Commons Wikimedia
2. «PGEX-3X cloning vector» By Magnus Manske – Δημιουργήθηκε από Magnus Manske (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia