Πώς να φτιάξετε Primers για PCR
Οι εκκινητές είναι ένα ουσιαστικό συστατικό στην ενίσχυση του DNA τόσο in vivo και in vitro . In vivo , το ένζυμο, DNA πολυμεράση απαιτεί έναν εκκινητή για την έναρξη της αντιγραφής του DNA. In vitro , οι εκκινητές χρησιμοποιούνται κυρίως για την έναρξη της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Ορισμένες άλλες τεχνικές, συμπεριλαμβανομένης της αλληλούχισης, της κλωνοποίησης, της τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης, κ.λπ. απαιτούν εκκινητές. Ως εκ τούτου, ο σχεδιασμός εκκινητών για in vitro οι τεχνικές γίνονται αρκετά απλές, αλλά μια διαδικασία προκλητική για τους μοριακούς βιολόγους. Επομένως, οι βασικοί κανόνες για το σχεδιασμό του εκκινητή τόσο για την PCR όσο και για τον προσδιορισμό αλληλουχίας συζητούνται σε αυτό το άρθρο.
Βασικές περιοχές που καλύπτονται
1. Τι είναι το Primer
– Ορισμός, Τύποι, Ρόλος
2. Πώς λειτουργούν τα Primers σε μια PCR
– Χαρακτηριστικά του DNA, Διαδικασία PCR
3. Πώς να φτιάξετε Primers για PCR
– Βασικοί κανόνες για το σχεδιασμό εκκινητών PCR
4. Πώς να σχεδιάσετε ένα εκκινητή αλληλουχίας
– Χαρακτηριστικά των εκκινητών αλληλουχίας
Βασικοί όροι:Σύνθεση DNA, μπροστινοί εκκινητές, μήκος, θερμοκρασία τήξης, PCR, αντίστροφοι εκκινητές, εκκινητές αλληλουχίας
Τι είναι το Primer
Ένας εκκινητής είναι ένας σύντομος κλώνος DNA ή RNA που χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση DNA. Τα ένζυμα που καταλύουν την αντιγραφή του DNA είναι ικανά να προσθέτουν νουκλεοτίδια σε ένα υπάρχον άκρο 3'. Ως εκ τούτου, ο εκκινητής θέτει τα θεμέλια για τη σύνθεση DNA χρησιμεύοντας ως πρωταρχικός παράγοντας. εκκινητές RNA χρησιμοποιούνται μέσα στο κύτταρο για την έναρξη της αντιγραφής του DNA από την DNA πολυμεράση. Ωστόσο, συνθετικά εκκινητές DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση του DNA, κυρίως με PCR και άλλες τεχνικές. Δύο τύποι εκκινητών χρησιμοποιούνται στην PCR, και είναι γνωστοί ως εμπρόσθιοι και ανάστροφοι εκκινητές. Κατά τη διάρκεια της PCR, εκατομμύρια αντίγραφα του επιθυμητού θραύσματος DNA μπορούν να παραχθούν πλαισιώνοντας τη συγκεκριμένη αλληλουχία DNA στο γονιδιωματικό DNA με εμπρόσθιους και ανάστροφους εκκινητές. Εμπρός και ανάστροφος εκκινητής που πλευρίζει μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA φαίνονται στην εικόνα 1 .
Εικόνα 1:Εμπρός και αντίστροφα εκκινητές
Πώς λειτουργούν τα Primers στην PCR
Το DNA είναι ένα μόριο που έχει δύο κλώνους που συγκρατούνται μεταξύ τους. Το μοτίβο του ζεύγους βάσεων είναι συμπληρωματικό με το καθένα και στα δύο σκέλη. Οι δύο κλώνοι συγκρατούνται μεταξύ τους από τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ συμπληρωματικών βάσεων αζώτου. Επιπλέον, κάθε σκέλος έχει τη δική του κατευθυντικότητα. Το ένα σκέλος έχει κατευθυντικότητα 5' έως 3' ενώ το άλλο έχει κατευθυντικότητα 3' έως 5'. Ως εκ τούτου, τα δύο σκέλη είναι αντιπαράλληλα. Ο κλώνος με κατεύθυνση 5' έως 3' είναι γνωστός ως κλώνος αίσθησης ενώ ο κλώνος με κατεύθυνση 3' προς 5' είναι γνωστός ως αντιπληροφοριακός κλώνος. Κάθε δύο κλώνοι θα πρέπει να συντίθενται ξεχωριστά κατά τη διάρκεια της PCR.
Τα τρία βήματα της PCR είναι η μετουσίωση, η ανόπτηση και η επιμήκυνση. Κατά τη μετουσίωση, οι δύο κλώνοι του DNA διαχωρίζονται με σπάσιμο των δεσμών υδρογόνου με θέρμανση στους 95 °C. Ο εμπρόσθιος εκκινητής δεσμεύεται στον νοηματικό κλώνο ενώ ο αντίστροφος εκκινητής συνδέεται στον αντιπληροφοριακό κλώνο. Η ανόπτηση των ασταριών γίνεται όταν η θερμοκρασία πέσει από 95 °C σε 50-60 °C. Ως εκ τούτου, και οι δύο κλώνοι μπορούν να συντεθούν ταυτόχρονα με τη βοήθεια του Taq πολυμεράση. Η ενίσχυση τόσο των νοητικών όσο και των αντιπληροφοριακών κλώνων συμβαίνει στην κατεύθυνση 5' προς 3'. Καθώς η PCR είναι μια εκθετική αντίδραση, τα τρία στάδια επαναλαμβάνονται σε 25-35 κύκλους. Τόσο τα εμπρός όσο και τα αντίστροφα εκκινητές χρησιμοποιούνται σε κάθε κύκλο για την παραγωγή περίπου 2 αντιγράφων του επιθυμητού θραύσματος DNA. Ο ρόλος των εκκινητών στην PCR φαίνεται στην εικόνα 2 .
Εικόνα 2: PCR
Πώς να φτιάξετε Primers για PCR
Για να ενισχυθεί ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA στο γονιδίωμα, αυτό το συγκεκριμένο θραύσμα DNA θα πρέπει να πλαισιώνεται τόσο από εμπρός όσο και από ανάστροφους εκκινητές. Ως εκ τούτου, και οι δύο εκκινητές θα πρέπει να είναι συμπληρωματικοί με τις αλληλουχίες που πλαισιώνουν το θραύσμα DNA. Οι βασικές οδηγίες για τον επιτυχημένο σχεδιασμό των εκκινητών PCR περιγράφονται παρακάτω.
- Η κατεύθυνση του εκκινητή προς τα εμπρός και προς τα πίσω πρέπει να είναι 5′ έως 3′.
- Το μήκος κάθε εκκινητή πρέπει να είναι από 18 έως 25 νουκλεοτίδια σε μήκος.
- Η περιεκτικότητα σε GC των εκκινητών κυμαίνεται μεταξύ 40 και 60% και η παρουσία ενός C ή G στο 3' άκρο του εκκινητή μπορεί να προάγει τη δέσμευση.
- Η θερμοκρασία τήξης και η θερμοκρασία τήξης (η θερμοκρασία στην οποία το μισό αστάρι έχει συγκολληθεί στο πρότυπο) του ζεύγους ασταριών πρέπει να είναι παρόμοια και πάνω από 60 °C. Η μέγιστη διαφορά πρέπει να είναι 5 °C.
- Το 3′ άκρο του εκκινητή πρέπει να ταιριάζει ακριβώς με το DNA του προτύπου.
- Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον βάσεις 2G ή C (σφιγκτήρας GC) στις τελευταίες 5 βάσεις στο 3′ άκρο του ασταριού. Ο σφιγκτήρας GC προάγει μια ισχυρή σύνδεση με την αλληλουχία στόχο.
- Οι θέσεις περιορισμού με 5-6 νουκλεοτίδια μπορούν να προστεθούν στο 5' άκρο του εκκινητή.
- Οι επαναλήψεις δινουκλεοτιδίου (ATATATAT) ή επαναλήψεις του ίδιου νουκλεοτιδίου περισσότερες από 4 φορές (ACCCC) θα πρέπει να αποφεύγονται στις αλληλουχίες εκκινητών. Αυτό προκαλεί λανθασμένη εκκίνηση.
- Η ομολογία εντός του εκκινητή ή οι δευτερεύουσες δομές των εκκινητών θα πρέπει να αποφεύγονται. Η ομολογία μεταξύ των εκκινητών ή οι συμπληρωματικές αλληλουχίες στους εμπρόσθιους και ανάστροφους εκκινητές θα πρέπει να αποφεύγονται. Και οι δύο συνθήκες μπορεί να σχηματίζουν αυτοδιμερή ή εκκινητές-διμερή.
- Η τιμή ΔG για την ανάλυση διμερών θα πρέπει να είναι μεταξύ 0 και -9 kcal/mole.
Πολλά διαδικτυακά εργαλεία είναι διαθέσιμα για την ευκολία του σχεδιασμού του ασταριού, όπως Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, κ.λπ. Η ιδιαιτερότητα των σχεδιασμένων εκκινητών μπορεί να προσδιοριστεί από το εργαλεία όπως το NCBI Primer-BLAST ή το UCSC in-silico PCR.
Εικόνα 3:Διεπαφή Primer 3
Πώς να σχεδιάσετε ένα Sequencing Primer
Οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας είναι σύντομοι, κλώνοι DNA, ακριβώς όπως οι εκκινητές PCR. Ωστόσο, οι εκκινητές PCR σχεδιάζονται για την ενίσχυση ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA ενώ οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας χρησιμοποιούνται για την αποκάλυψη της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του ενισχυμένου θραύσματος DNA με PCR. Σε αντίθεση με τους εκκινητές PCR, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας μόνο εκκινητής στην αλληλούχιση, εάν μόνο η αλληλουχία στόχος είναι μικρότερη από 500 bp σε μήκος. Ως παράδειγμα, ο εμπρόσθιος εκκινητής της PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον προσδιορισμό της αλληλουχίας, για να ενισχύσει μόνο τον κλώνο αίσθησης. Επιπλέον, ο βαθμός αναντιστοιχιών που γίνεται ανεκτός κατά την αντίδραση προσδιορισμού αλληλουχίας είναι υψηλότερος από την PCR. Γενικά, οι εκκινητές PCR είναι συμπληρωματικοί προς την αλληλουχία στόχο. Ωστόσο, ορισμένοι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας δεν σχετίζονται με την αλληλουχία στόχο. Είναι γνωστά ως γενικά αστάρια. Καθολικοί εκκινητές όπως T7 ή SP6 ανόπτονται στον φορέα που φέρει την αλληλουχία στόχο. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο για μια ποικιλία φορέων όσο και για διάφορους τύπους θραυσμάτων DNA.
Συμπέρασμα
Οι εκκινητές χρησιμοποιούνται στην PCR και στον προσδιορισμό της αλληλουχίας για την έναρξη της σύνθεσης DNA. Δύο τύποι εκκινητών PCR μπορούν να αναγνωριστούν ως εμπρός και ανάστροφος εκκινητής. Οι μπροστινοί εκκινητές ανόπτονται στον νοηματικό κλώνο ενώ οι αντίστροφοι εκκινητές ανόπτονται στον αντιπληροφοριακό κλώνο. Στην αλληλούχιση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε εμπρόσθιος είτε αντίστροφος εκκινητής για την ενίσχυση του στόχου. Κατά το σχεδιασμό των εκκινητών, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη πολλοί παράγοντες, όπως το μήκος του ασταριού, το Tm και η περιεκτικότητα σε GC. Πολλά διαδικτυακά εργαλεία είναι διαθέσιμα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό εκκινητών για μια συγκεκριμένη ακολουθία.
Αναφορά:
1. «Σχεδίαση Primer:Συμβουλές για μια αποτελεσματική διαδικασία». Genome Compiler Corporation, 3 Νοεμβρίου 2015, Διαθέσιμο εδώ.
2. "Sequencing primers and primer design." Sequencing primers and primer design, University of Calgary, Διαθέσιμο εδώ.
Εικόνα Ευγενική προσφορά:
1. “Primers RevComp” By Zephyris – Own work (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. “Polymerase chain reagim” By Enzoklop – Own work (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
