Ποιες είναι οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό των τμημάτων DNA διαφορετικών μηκών;
1. Προετοιμασία δείγματος:
* Το DNA εκχυλίζεται από κύτταρα και στη συνέχεια αφομοιώνεται με ένζυμα περιορισμού. Αυτά τα ένζυμα κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες, δημιουργώντας θραύσματα διαφορετικών μεγεθών.
* Τα θραύσματα DNA στη συνέχεια αναμιγνύονται με ένα ρυθμιστικό φόρτωσης που περιέχει βαφή (συνήθως μπλε βρωμοφαινόλης) για ορατότητα και πυκνή λύση (όπως η γλυκερόλη) για να τους βοηθήσει να βυθιστούν στο πήκτωμα.
2. Παρασκευή πηκτής:
* Ένα πήκτωμα γίνεται με πορώδη υλικό όπως αγαρόζη ή πολυακρυλαμίδιο. Το πήκτωμα λειτουργεί ως κόσκινο, επιτρέποντας στα μικρότερα θραύσματα DNA να μετακινούνται πιο εύκολα από τα μεγαλύτερα θραύσματα.
* Το πήκτωμα τοποθετείται σε ένα θάλαμο ηλεκτροφόρησης γεμάτο με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που διεξάγει ηλεκτρική ενέργεια.
3. Ηλεκτροφόρηση:
* Τα δείγματα DNA φορτώνονται σε πηγάδια στο ένα άκρο του πηκτώματος.
* Εφαρμόζεται ένα ηλεκτρικό ρεύμα σε όλη τη γέλη.
* Το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο, οπότε μεταναστεύει προς το θετικό ηλεκτρόδιο.
* Μικρότερα θραύσματα DNA κινούνται μέσω του πηκτώματος ταχύτερα από τα μεγαλύτερα θραύσματα, με αποτέλεσμα ένα διαχωρισμό που βασίζεται στο μέγεθος.
4. Οπτικοποίηση:
* Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα θραύσματα ϋΝΑ χρωματίζονται με φθορίζουσα βαφή (όπως το βρωμίδιο αιθιδίου ή το SYBR πράσινο) που συνδέεται με το DNA και μπορεί να απεικονιστεί κάτω από το φως UV.
* Τα θραύσματα DNA εμφανίζονται ως ζώνες στο πήκτωμα, με μικρότερα θραύσματα να εμφανίζονται πιο κάτω από το πήκτωμα.
Άλλες μέθοδοι διαχωρισμού των τμημάτων DNA διαφορετικών μηκών:
* χρωματογραφία: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί διαφορετικές ιδιότητες των θραυσμάτων DNA για να τα χωρίσει, όπως η συγγένειά τους για μια στατική φάση.
* Ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς: Παρόμοια με την ηλεκτροφόρηση πηκτής, αλλά χρησιμοποιεί ένα στενό τριχοειδές σωλήνα αντί για ένα πήκτωμα. Αυτή η μέθοδος προσφέρει υψηλότερη ανάλυση και ταχύτερο διαχωρισμό.
* κλασμάτωση ροής πεδίου (FFF): Αυτή η τεχνική διαχωρίζει τα μόρια με βάση τις ιδιότητες μεγέθους και διάχυσης. Χρησιμοποιεί μια στρώση ροής ενός υγρού φορέα και ενός πεδίου (όπως ένα βαρυτικό ή ηλεκτρικό πεδίο) για να διαχωρίσει τα σωματίδια.
Εφαρμογές διαχωρισμού DNA:
* Γενετική ανάλυση: Προσδιορισμός μεταλλάξεων, γενετικών διαταραχών και δοκιμών πατρότητας.
* Ιατροδικαστική: Ταιριάζουν δείγματα DNA από σκηνές εγκλήματος σε υπόπτους.
* Έρευνα: Μελετώντας την γονιδιακή έκφραση, τη ρύθμιση των γονιδίων και τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών.
* Βιοτεχνολογία: Ανάπτυξη νέων φαρμάκων και διαγνωστικών εργαλείων.
Η επιλογή της μεθόδου για τον διαχωρισμό των τμημάτων DNA εξαρτάται από τη συγκεκριμένη εφαρμογή και το εύρος μεγέθους των θραυσμάτων που μελετώνονται.
