Πώς επιλέγονται τα κύτταρα που περιέχουν ανασυνδυασμένο DNA;
1. Δείκτες αντοχής αντιβιοτικών:
* Αρχή: Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην εισαγωγή ενός γονιδίου αντοχής στα αντιβιοτικά μαζί με το επιθυμητό γονίδιο στον φορέα. Τα κύτταρα που αναλαμβάνουν επιτυχώς τον ανασυνδυασμένο φορέα θα αποκτήσουν επίσης αντίσταση στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό.
* Διαδικασία: Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε μέσα που περιέχουν το αντιβιοτικό. Μόνο κύτταρα που έχουν πάρει το ανασυνδυασμένο φορέα και εκφράζουν το γονίδιο αντίστασης θα επιβιώσουν και θα σχηματίσουν αποικίες.
* Παράδειγμα: Το κοινώς χρησιμοποιούμενο γονίδιο αντίστασης αμπικιλλίνης (AMPR) επιτρέπει στα βακτήρια να επιβιώσουν παρουσία αμπικιλλίνης.
2. Γονίδια αναφοράς:
* Αρχή: Τα γονίδια αναφοράς κωδικοποιούν πρωτεΐνες που παράγουν ένα ανιχνεύσιμο σήμα, επιτρέποντας την εύκολη ταυτοποίηση κυττάρων που περιέχουν το ανασυνδυασμένο DNA.
* Διαδικασία: Τα γονίδια αναφοράς συχνά συνδέονται με το επιθυμητό γονίδιο, οπότε η έκφραση του γονιδίου αναφοράς υποδεικνύει την επιτυχή εισαγωγή του ανασυνδυασμένου DNA.
* Παραδείγματα:
* γονίδιο LACZ: Κωδικοποιεί τη βήτα-γαλακτοσιδάση, η οποία διασπά ένα υπόστρωμα (x-gal) για να παράγει ένα μπλε χρώμα.
* γονίδιο GFP: Κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, η οποία κάνει τα κύτταρα να λάμπουν πράσινα κάτω από το υπεριώδες φως.
3. Επιλογή χρωμάτων:
* Αρχή: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα γενετικό σύστημα όπου η παρουσία του ανασυνδυασμένου DNA αλλάζει το χρώμα των κυττάρων.
* Διαδικασία: Τα κύτταρα που περιέχουν το ανασυνδυασμένο DNA θα εμφανίζουν διαφορετικό χρώμα σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς αυτό.
* Παράδειγμα: Η μέθοδος μπλε-λευκού διαλογής χρησιμοποιεί ένα διάνυσμα με το γονίδιο LACZ που διαταράσσεται από τη θέση εισαγωγής για το ανασυνδυασμένο DNA. Τα κύτταρα με το ανασυνδυασμένο DNA θα παράγουν λευκές αποικίες, ενώ τα κύτταρα χωρίς αυτό θα παράγουν μπλε αποικίες.
4. Συμπλήρωση:
* Αρχή: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται όταν το επιθυμητό γονίδιο απαιτείται για να επιβιώσει το κύτταρο ή να παράγει ένα συγκεκριμένο προϊόν.
* Διαδικασία: Τα κύτταρα που δεν έχουν λειτουργικό γονίδιο μετασχηματίζονται με τον ανασυνδυασμένο φορέα που περιέχει το γονίδιο. Μόνο τα κύτταρα με το λειτουργικό γονίδιο θα επιβιώσουν ή θα παράγουν το επιθυμητό προϊόν.
* Παράδειγμα: Ένα στέλεχος βακτηρίων που δεν έχει συγκεκριμένο ένζυμο μπορεί να μετασχηματιστεί με ένα διάνυσμα που περιέχει το γονίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο. Μόνο τα μετασχηματισμένα βακτήρια θα μπορούν να επιβιώσουν και να αναπτυχθούν.
5. Διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένου φθορισμού (FACS):
* Αρχή: Το FACS χρησιμοποιεί την επισήμανση φθορισμού για τον εντοπισμό και την ταξινόμηση των κυττάρων με βάση συγκεκριμένα χαρακτηριστικά.
* Διαδικασία: Τα κύτταρα που εκφράζουν το επιθυμητό γονίδιο (που συνδέονται με έναν φθορίζοντα δείκτη) ταξινομούνται από τα υπόλοιπα με βάση τις ιδιότητες φθορισμού τους.
* Πλεονεκτήματα: Έλεγχος υψηλής απόδοσης, ακριβής διαχωρισμός και αποτελεσματική ταξινόμηση κυττάρων.
6. PCR προβολή:
* Αρχή: Η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, επιβεβαιώνοντας την παρουσία του ανασυνδυασμένου DNA.
* Διαδικασία: Το DNA εκχυλίζεται από κύτταρα και ενισχύεται χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικά για το εισαγόμενο γονίδιο. Η παρουσία του ενισχυμένου προϊόντος υποδεικνύει επιτυχή εισαγωγή.
Η επιλογή της μεθόδου επιλογής εξαρτάται από το συγκεκριμένο πείραμα, τον χρησιμοποιούμενο φορέα και το επιθυμητό αποτέλεσμα.
