Πώς θα εντοπίσετε τα κύτταρα που φέρουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο;
1. Επιλογή με αντίσταση στα αντιβιοτικά:
* Πώς λειτουργεί: Τα περισσότερα πλασμίδια φέρουν ένα γονίδιο αντοχής στα αντιβιοτικά. Όταν μετατρέπετε τα βακτήρια με το πλασμίδιο, μόνο εκείνα τα βακτήρια που έχουν πάρει το πλασμίδιο θα επιβιώσουν σε ένα μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό.
* Παράδειγμα: Ένα κοινό γονίδιο αντίστασης αντιβιοτικών είναι η αντίσταση στην αμπικιλλίνη (AMPR). Εάν το πλασμίδιο σας περιέχει το γονίδιο AMPR, μπορείτε να πιέσετε τα βακτήρια σας σε ένα μέσο που περιέχει αμπικιλλίνη. Μόνο τα βακτήρια με το πλασμίδιο θα αναπτυχθούν, ενώ εκείνοι χωρίς αυτό θα πεθάνουν.
2. Μπλε-λευκή προβολή:
* Πώς λειτουργεί: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί το γονίδιο LACZ, το οποίο κωδικοποιεί ένα ένζυμο που διασπά ένα υπόστρωμα για να δημιουργήσει ένα μπλε χρώμα. Το πλασμίδιο θα περιέχει ένα αντίγραφο του γονιδίου LACZ που έχει διαταραχθεί (αδρανοποιημένο). Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο θα έχει διαταραχθεί το γονίδιο LACZ του από την εισαγωγή του γονιδίου σας ενδιαφέροντος. Τα βακτήρια που μετασχηματίζονται με το μη-αναστολικό πλασμίδιο θα παράγουν το ένζυμο και θα εμφανιστούν μπλε σε ένα μέσο που περιέχει το υπόστρωμα, ενώ τα βακτήρια μετασχηματισμένα με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο δεν θα παράγουν το ένζυμο και θα εμφανιστούν λευκά.
* Πλεονεκτήματα: Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την ταχεία και εύκολη ταυτοποίηση των ανασυνδυαστών.
* Σημείωση: Αυτή η μέθοδος απαιτεί έναν συγκεκριμένο τύπο πλασμιδίου που ονομάζεται "φορέας LACZ".
3. Colony PCR:
* Πώς λειτουργεί: Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει την εκτέλεση PCR σε αποικίες βακτηρίων για την ενίσχυση ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA που υπάρχει στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο αλλά όχι στο αρχικό πλασμίδιο.
* Πλεονεκτήματα: Αυτή η μέθοδος είναι εξαιρετικά συγκεκριμένη και μπορεί να επιβεβαιώσει την παρουσία του εισαγόμενου γονιδίου.
* Σημείωση: Αυτή η μέθοδος απαιτεί συγκεκριμένους εκκινητές για το γονίδιο ενδιαφέροντος και έναν θερμοκυκλικό PCR.
4. Περιορισμός ενζύμου πέψη:
* Πώς λειτουργεί: Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει την πέψη του πλασμιδίου DNA με συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο θα έχει διαφορετικό πρότυπο περιορισμού σε σύγκριση με το αρχικό πλασμίδιο λόγω του εισαγόμενου γονιδίου.
* Πλεονεκτήματα: Αυτή η μέθοδος μπορεί να επιβεβαιώσει την παρουσία του εισαγόμενου γονιδίου και του προσανατολισμού του.
* Σημείωση: Αυτή η μέθοδος απαιτεί γνώση των θέσεων περιορισμού στο πλασμίδιο και το γονίδιο ενδιαφέροντος.
5. Φθορίζοντες δείκτες:
* Πώς λειτουργεί: Ορισμένα πλασμίδια περιέχουν φθορίζουσες πρωτεΐνες (όπως GFP) που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση μετασχηματισμένων κυττάρων κάτω από ένα φθορίζοντα μικροσκόπιο.
* Πλεονεκτήματα: Αυτή η μέθοδος είναι πολύ οπτική και επιτρέπει την εύκολη ταυτοποίηση μετασχηματισμένων κυττάρων.
* Σημείωση: Αυτή η μέθοδος απαιτεί μικροσκόπιο με φίλτρο φθορισμού.
6. Στύπωμα Western:
* Πώς λειτουργεί: Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του πρωτεϊνικού προϊόντος του γονιδίου ενδιαφέροντος.
* Πλεονεκτήματα: Αυτή η μέθοδος μπορεί να επιβεβαιώσει ότι το γονίδιο έχει κλωνοποιηθεί με επιτυχία και εκφράζεται.
* Σημείωση: Αυτή η μέθοδος απαιτεί αντισώματα ειδικά για την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος.
Η καλύτερη μέθοδος για τον εντοπισμό ανασυνδυασμένων κυττάρων θα εξαρτηθεί από το συγκεκριμένο πλασμίδιο και το γονίδιο ενδιαφέροντος. Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε ένα συνδυασμό μεθόδων για να εξασφαλίσετε τα πιο ακριβή αποτελέσματα.
