Πώς δημιουργούνται διαγονιδιακά ποντίκια;

Δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών:Οδηγός βήμα προς βήμα

Η δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών περιλαμβάνει την εισαγωγή ξένου DNA στο γονιδίωμα του ποντικού, με αποτέλεσμα τους απογόνους που εκφράζουν το νέο γονίδιο. Ακολουθεί μια ανάλυση των κοινών μεθόδων:

1. Κατασκευή του διαγονιδίου:

* Προσδιορίστε και απομονώστε το επιθυμητό γονίδιο: Αυτό θα μπορούσε να είναι ένα γονίδιο από έναν άλλο οργανισμό, μια τροποποιημένη εκδοχή ενός γονιδίου ποντικού ή ενός εντελώς συνθετικού γονιδίου.

* Σχεδιάστε το κατασκεύασμα διαγονιδίων: Αυτό συνεπάγεται την ενσωμάτωση ρυθμιστικών στοιχείων (υποκινητές και ενισχυτές) για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης και την ενδεχόμενη προσθήκη γονιδίων αναφοράς για εύκολη παρακολούθηση.

* Γραμμικοποιήστε το διαγονίδιο: Αυτό προετοιμάζει το DNA για ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή.

2. Μέθοδοι παράδοσης:

* Pronuclear Injection: Αυτή είναι η πιο συνηθισμένη μέθοδος.

* Τα γονιμοποιημένα αυγά συλλέγονται από θηλυκά ποντίκια.

* Το διαγονίδιο εγχέεται στον προπένιο του γονιμοποιημένου αυγού (πριν από την ασφάλεια των πυρήνων).

* Τα αυγά που εισάγονται εμφυτεύονται σε υποκατάστατες μητέρες.

* Ένεση εμβρυϊκού βλαστοκυττάρου (ESC):

* ESCs είναι καλλιεργημένα και γενετικά τροποποιημένα για να περιέχουν το διαγονίδιο.

* Οι τροποποιημένες ESC εισάγονται σε βλαστοκύστες (έμβρυα πρώιμου σταδίου)

* Αυτά τα χιμαιρικά έμβρυα (που περιέχουν τόσο πρωτότυπα όσο και τροποποιημένα κύτταρα) εμφυτεύονται σε αναπληρωτές μητέρες.

* Οι απόγονοι που μεταφέρουν το διαγονίδιο στην βλαστική γραμμή τους αναγνωρίζονται.

* Viral Vectors:

* Οι ιοί είναι σχεδιασμένοι για να μεταφέρουν το διαγονίδιο και να το παραδώσουν σε κύτταρα -στόχους.

* Οι ιοί εισάγονται σε έμβρυα ή ενήλικα ποντίκια.

* Το διαγονίδιο ενσωματώνεται στο γονιδίωμα των μολυσμένων κυττάρων.

3. Έλεγχος και χαρακτηρισμός:

* Προσδιορίστε διαγονιδιακά ζώα: Η PCR και η κηλίδωση Southern χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό των ιδρυτών (ποντίκια που έχουν ενσωματωθεί το διαγονίδιο στο γονιδίωμα τους) και τους απογόνους τους.

* Αξιολογήστε την έκφραση των διαγονιδίων: Τεχνικές όπως η RT-PCR, η κηλίδωση Western και η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιούνται για να εκτιμηθεί η έκφραση του διαγονιδίου σε διαφορετικούς ιστούς.

* Ανάλυση φαινοτύπου: Εξετάζονται οι επιδράσεις του διαγονιδίου στη φυσιολογία, τη συμπεριφορά και την ευαισθησία των ασθενειών του ζώου.

4. Αναπαραγωγή και διατήρηση διαγονιδιακών γραμμών:

* Οι διαγονιδιακοί ιδρυτές εκτρέφονται για να δημιουργήσουν μια αποικία διαγονιδιακών ζώων.

* Η τακτική αναπαραγωγή εξασφαλίζει τη σταθερή μετάδοση του διαγονιδίου σε επόμενες γενιές.

* Το γενετικό υπόβαθρο της διαγονιδιακής γραμμής ελέγχεται προσεκτικά για να αποφευχθούν ανεπιθύμητες παραλλαγές.

Σημείωση:

* Τα διαγονιδιακά ποντίκια είναι ισχυρά εργαλεία για την έρευνα, αλλά απαιτούν προσεκτικές ηθικές εκτιμήσεις και σωστή κτηνοτροφία.

* Οι συγκεκριμένες μεθόδους και πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών μπορεί να διαφέρουν ανάλογα με το επιθυμητό αποτέλεσμα και το συγκεκριμένο γονίδιο ενδιαφέροντος.

Αυτή είναι μια απλοποιημένη επισκόπηση. Η δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει μια σειρά τεχνικών και εμπειρογνωμοσύνης.