Πρωτόκολλο για αναγωγάση νιτρικού άλατος χρησιμοποιώντας νιτρώδες νάτριο ως πρότυπο;

Πρωτόκολλο για δοκιμασία αναγωγάσης νιτρικού άλατος χρησιμοποιώντας νιτρώδες νάτριο ως πρότυπο

Αυτό το πρωτόκολλο περιγράφει μια κοινή μέθοδο για τη μέτρηση της δραστικότητας της αναγωγάσης νιτρικού άλατος χρησιμοποιώντας νιτρώδες νάτριο ως πρότυπο.

Υλικά:

* Φυτικό υλικό: Φρέσκα φύλλα, ρίζες ή άλλοι ιστοί που περιέχουν αναγωγάση νιτρικού άλατος.

* buffer εκχύλισης:

* 100 mm buffer Tris-HCl, ρΗ 7.5

* 1 mm EDTA

* 10 mm DTT (Dithiothreitol)

* 0,1% (β/ο) αλβουμίνη βόειου ορού (BSA)

* Μείγμα αντίδρασης:

* 100 mM φωσφορικό καλύλιο, ρΗ 7,5

* 10 mm νιτρικό νάτριο

* 1 mm Nadh

* Πρότυπο νιτρωδών νάτριο: Προετοιμάστε μια τυποποιημένη λύση γνωστής συγκέντρωσης (π.χ., 100 ppm).

* αντιδραστήριο Griess: (Ανατρέξτε σε συγκεκριμένες οδηγίες πρωτοκόλλου)

* φασματοφωτόμετρο: Για τη μέτρηση της απορρόφησης στα 540 nm.

* Φυγοκεντρική: Για το διαχωρισμό των κυτταρικών υπολειμμάτων.

* πάγο: Για να διατηρήσετε τις κρύες θερμοκρασίες.

* πιπέτες και συμβουλές: Για ακριβείς μετρήσεις όγκου.

Διαδικασία:

1. Προετοιμασία δείγματος:

* Υλικό συγκομιδής και ξεπλύνετε γρήγορα με κρύο αποσταγμένο νερό.

* Ζυγίστε μια κατάλληλη ποσότητα ιστού (π.χ., 0,1-1 g) και αλέστε το σε κονίαμα και γουδοχέρι με υγρό άζωτο ή χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή σε ρυθμιστικό εκχύλισης.

* Φυγοκεντρήστε το ομογενοποίηση στα 10.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθείτε τα κυτταρικά υπολείμματα. Το υπερκείμενο είναι το εκχύλισμα ενζύμου σας.

2. Δοκιμασία αναγωγάσης νιτρικού άλατος:

* Προετοιμάστε μια σειρά σωλήνων που περιέχουν το μίγμα της αντίδρασης, συμπεριλαμβανομένων των κενών χωρίς εκχύλισμα ενζύμου και σωλήνων με ποικίλες συγκεντρώσεις προτύπου νιτρωδών νατρίου.

* Προσθέστε έναν κατάλληλο όγκο εκχυλίσματος ενζύμου στους σωλήνες αντίδρασης.

* Ξεκινήστε την αντίδραση προσθέτοντας NADH.

* Επωάστε τους σωλήνες στους 30 ° C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα (π.χ. 30 λεπτά).

* Τερματίστε την αντίδραση προσθέτοντας αντιδραστήριο Griess.

3. Μέτρηση της παραγωγής νιτρωδών:

* Επωφεληθείτε από τους σωλήνες στο σκοτάδι για τουλάχιστον 15 λεπτά για να επιτρέψετε την ανάπτυξη χρώματος.

* Μετρήστε την απορρόφηση στα 540 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο.

* Προετοιμάστε μια τυπική καμπύλη χρησιμοποιώντας τις γνωστές συγκεντρώσεις νιτρώδους νατρίου.

* Υπολογίστε την ποσότητα νιτρωδών που παράγεται από το εκχύλισμα ενζύμου χρησιμοποιώντας την τυπική καμπύλη.

4.

* Εκφράζοντας δραστικότητα αναγωγάσης νιτρικών ως μmoles νιτρώδη που παράγονται ανά λεπτό ανά γραμμάριο φρέσκου βάρους (FW) ή πρωτεΐνης .

Σημείωση:

* Αυτό το πρωτόκολλο είναι ένα βασικό περίγραμμα και οι ειδικές τροποποιήσεις μπορεί να είναι απαραίτητες ανάλογα με το είδος των φυτών και την πειραματική ρύθμιση.

* Βεβαιωθείτε ότι όλες οι λύσεις παρασκευάζονται φρέσκα και αποθηκεύονται κατάλληλα.

* Χρησιμοποιήστε αντιδραστήρια υψηλής ποιότητας για ακριβή αποτελέσματα.

* Έλεγχος για την απορρόφηση υποβάθρου μετρώντας την απορρόφηση των κενών χωρίς εκχύλισμα ενζύμου.

* Επαναλάβετε τον προσδιορισμό τουλάχιστον τρεις φορές για να εξασφαλίσετε την αναπαραγωγιμότητα.

αντιδραστήριο Griess:

* Το αντιδραστήριο Griess χρησιμοποιείται για την ανίχνευση νιτρωδών αντιδρώντας με αυτό για να παράγει μια πορφυρή χρωστική ουσία.

* Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διαφορετικά αντιδραστήρια Griess, οπότε ανατρέξτε στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο για την προετοιμασία και τη χρήση.

Εναλλακτικές μέθοδοι:

* Άλλες μέθοδοι για τη μέτρηση της δραστικότητας αναγωγάσης νιτρικών περιλαμβάνουν τη χρήση νιτρικού ως υπόστρωμα και την ανίχνευση της μείωσης των νιτρικών σε νιτρώδη.

* φασματοφωτομετρική μέτρηση Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να μετρηθεί άμεσα η μεταβολή της συγκέντρωσης NADH με την πάροδο του χρόνου.

ερμηνεία:

Η δραστικότητα αναγωγάσης νιτρικού άλατος είναι ένας δείκτης της ικανότητας του φυτού να μειώνει τα νιτρικά σε νιτρώδη, το οποίο είναι ένα κρίσιμο βήμα στην αφομοίωση του αζώτου. Η σύγκριση της δραστηριότητας σε διαφορετικούς ιστούς ή υπό διαφορετικές συνθήκες μπορεί να αποκαλύψει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τον μεταβολισμό του αζώτου του φυτού.

Περισσότερες πληροφορίες:

* Τροποποιήσεις πρωτοκόλλου για συγκεκριμένα είδη φυτών ή συνθήκες: Ανατρέξτε στη σχετική επιστημονική βιβλιογραφία ή στους εμπειρογνώμονες επικοινωνίας για καθοδήγηση.

* Αντιμετώπιση προβλημάτων: Συμβουλευτείτε οδηγούς αντιμετώπισης προβλημάτων ή συμβουλευτείτε εμπειρογνώμονες εάν αντιμετωπίσετε προβλήματα με τον προσδιορισμό.

Αυτό το πρωτόκολλο παρέχει ένα γενικό πλαίσιο για τη μέτρηση της δραστικότητας της αναγωγάσης νιτρικού άλατος χρησιμοποιώντας νιτρώδες νάτριο ως πρότυπο. Προσαρμόστε το στις συγκεκριμένες ανάγκες σας και εξασφαλίστε ακριβή αποτελέσματα.