Τι είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και πώς λειτουργεί;

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή PCR είναι μια μέθοδος για τη δημιουργία χιλιάδων αντιγράφων ενός κλώνου DNA. Εκμεταλλεύεται την ικανότητα των ενζύμων πολυμεράσης να δημιουργούν αντίγραφα του γενετικού υλικού σε εργαστηριακές συνθήκες.

Το DNA (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) αποτελεί τη βάση για αμέτρητες ερευνητικές μελέτες που αφορούν ζωντανούς οργανισμούς. Από τον κώδικα του DNA, μπορούμε να συλλέξουμε τη γενετική βάση των ασθενειών, να αναπτύξουμε φάρμακα, να πραγματοποιήσουμε ιατροδικαστικές εξετάσεις, να εντοπίσουμε μικρόβια και πολλά άλλα.

Το πιο βασικό πράγμα που χρειάζεται για μια τέτοια έρευνα είναι μεγάλες ποσότητες του υπό διερεύνηση θραύσματος DNA. Ωστόσο, το DNA που απομονώνεται από τα κύτταρα, τους ιστούς ή οποιαδήποτε άλλη βιολογική πηγή συχνά δεν είναι αρκετό για την ανάλυση. Επομένως, οι επιστήμονες πρέπει να δημιουργήσουν περισσότερα αντίγραφα του DNA.

Εδώ εμφανίζεται ο κρίσιμος ρόλος της «αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης».

Τι είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης;

Η PCR εκμεταλλεύεται την ικανότητα των ενζύμων πολυμεράσης να δημιουργούν αντίγραφα του γενετικού υλικού υπό εργαστηριακές συνθήκες.

Πριν από την PCR, αντίγραφα του DNA έγιναν απομονώνοντας ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA και εισάγοντάς το στο γονιδίωμα των ζωντανών κυττάρων. Τα ζωντανά κύτταρα αντιγράφουν το εισαγόμενο DNA ενώ αντιγράφουν το δικό τους DNA. Η τεχνική ήταν ένας επίπονος και χρονοβόρος τρόπος για τη δημιουργία αντιγράφων DNA επαρκών για περαιτέρω μελέτη.

Ωστόσο, αυτό δεν ισχύει πλέον. Τα περισσότερα εύσημα γι' αυτή την πρόοδο ανήκει στον Kary Mullis, ο οποίος εφηύρε την "αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης" (PCR) το 1983, σηματοδοτώντας την αρχή της "Βιοτεχνολογικής Επανάστασης". Σήμερα, η PCR είναι μια πολύ κοινή εργαστηριακή τεχνική ακόμη και σε μικρότερα εργαστήρια και χρησιμοποιείται για τη δημιουργία αντιγράφων DNA σε τακτική βάση.

Η PCR μπορεί επιλεκτικά να δημιουργήσει αντίγραφα του DNA που μας ενδιαφέρει μέσω μιας διαδικασίας που συχνά είναι γνωστή ως «μοριακή φωτοτυπία». Μόλις συντεθούν πολλά αντίγραφα του DNA χρησιμοποιώντας PCR, το DNA "ενισχύεται".

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια in vitro τεχνική που χρησιμοποιεί πολυμεράση DNA για να δημιουργήσει πολλά αντίγραφα του DNA που μας ενδιαφέρει. (Προστασία φωτογραφίας :kozhedub_nc/Shutterstock)

Ποια είναι τα συστατικά μιας αντίδρασης PCR;

Τα βασικά συστατικά μιας αντίδρασης PCR είναι το πρότυπο DNA, οι εκκινητές, τα νουκλεοτίδια και η θερμοσταθερή πολυμεράση DNA. Ας μάθουμε εν συντομία για καθένα από αυτά τα στοιχεία.

Το DNA από τα πιο απλά βακτήρια έως τα πιο πολύπλοκα ζώα και φυτά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για PCR. Ωστόσο, ολόκληρο το DNA (το DNA του προτύπου) δεν περνά μέσω της PCR. μόνο ένα μικρό τμήμα θα ενισχυθεί κατά τη διάρκεια της διαδικασίας.

Για να ενισχυθεί το DNA, οι εκκινητές - μικρά τμήματα νουκλεοτιδίων (περίπου 20 bp) - είναι πολύ σημαντικά. Χρησιμοποιείται ένα σετ εκκινητών, τόσο ένα εμπρόσθιο αστάρι όσο και ένα ανάστροφο αστάρι. Οι εκκινητές συνδέονται με την αρχή και το τέλος των κλώνων DNA, σηματοδοτώντας τα σημεία από τα οποία πρέπει να ενισχυθεί ο κλώνος DNA.

Τα νουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται για την αντίδραση PCR είναι ένα μείγμα και των τεσσάρων αζωτούχων βάσεων που βρίσκονται στο DNA. Είναι η αδενίνη (Α), η θυμίνη (Τ), η γουανίνη (G) και η κυτοσίνη (C).

Το τελευταίο και πιο σημαντικό συστατικό είναι η DNA πολυμεράση. Ένα ένζυμο πολυμεράσης δημιουργεί νέα μόρια DNA συναρμολογώντας τα νουκλεοτίδια, με τρόπο που είναι συμπληρωματικός του υπάρχοντος κλώνου. Με αυτόν τον τρόπο, μπορεί πραγματικά να δημιουργήσει δύο πανομοιότυπα μόρια DNA από έναν μόνο κλώνο DNA.

Μαζί με το ένζυμο, στο μίγμα της αντίδρασης πρέπει να προστεθούν και οι συμπαράγοντες που απαιτούνται για τη δράση της DNA πολυμεράσης. Οι συμπαράγοντες είναι οι μεταλλικές ενώσεις που είναι κρίσιμες για την ενζυμική δραστηριότητα. Τα ιόντα μαγνησίου είναι οι συμπαράγοντες για την πολυμεράση DNA.

Η πολυμεράση DNA που χρησιμοποιείται στην PCR είναι η θερμοσταθερή πολυμεράση DNA (συχνά αποκαλούμενη πολυμεράση Taq) που απομονώνεται από θερμόφιλους οργανισμούς που μπορούν να επιβιώσουν σε υψηλές θερμοκρασίες.

Τα συστατικά μιας αντίδρασης PCR περιλαμβάνουν το εκμαγείο DNA, Taq DNA πολυμεράση, MgCl2 ως ρυθμιστικό διάλυμα, νουκλεοτιδικές βάσεις (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ανάντη (εμπρός) εκκινητή, κατάντη (αντίστροφο) εκκινητή και εξαιρετικά καθαρό νερό. (Φωτογραφία:Oscar Daniel Luna Ramos/Shutterstock)

Ποια είναι τα βήματα μιας αντίδρασης PCR;

Τώρα που γνωρίζουμε όλα τα συστατικά που απαιτούνται για την PCR, ας δούμε τα τρία βήματα που εμπλέκονται σε μια αντίδραση PCR. Τα βήματα είναι η μετουσίωση, η ανόπτηση και η επέκταση.

Η δραστικότητα της πολυμεράσης εξαρτάται από την παρουσία μονόκλωνου DNA στο οποίο μπορούν να συνδεθούν οι εκκινητές. Αυτό μπορεί απλά να επιτευχθεί με θέρμανση του δείγματος DNA στους 94-98° Γ.

Η θέρμανση σπάει τους δεσμούς που συγκρατούν τους δύο κλώνους DNA μαζί. Η διαδικασία ονομάζεται μετουσίωσης, καθώς το δίκλωνο μόριο DNA μετουσιώνεται σε δύο μονόκλωνα μόρια. Ένας κλώνος DNA θα ονομάζεται κλώνος προτύπου, ενώ το ζεύγος του ονομάζεται συμπληρωματικός κλώνος.

Το επόμενο βήμα απαιτεί από τους εκκινητές να δεσμευτούν (ανόπτηση) στο πρότυπο DNA σε συγκεκριμένες θέσεις. Ο μπροστινός εκκινητής δεσμεύεται στην αρχή του εκμαγείου DNA (ένας κλώνος στο δίκλωνο DNA) στην νουκλεοτιδική αλληλουχία 3 bp ATG (κωδόνιο έναρξης). Ο αντίστροφος εκκινητής δεσμεύεται στο άκρο του συμπληρωματικού DNA (ο δεύτερος κλώνος του δίκλωνου DNA) κλώνου στις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων 3 bp TAG, ΤΑΑ ή TGA (κωδικόνια τερματισμού). Το DNA μεταξύ των κωδικονίων έναρξης και λήξης ενισχύεται.

Η επιτυχία αυτού του βήματος εξαρτάται από την αλληλουχία εκκινητών και τη θερμοκρασία που επιλέγεται για ανόπτηση, συνήθως 50-65° ΝΤΟ.

Το τελευταίο και τελευταίο βήμα είναι η επιμήκυνση ή ο τερματισμός, που συμβαίνει στους 72° C, η βέλτιστη θερμοκρασία για τη δράση της πολυμεράσης Taq. Η DNA πολυμεράση θα αναγνωρίσει την συνδεδεμένη με τον εκκινητή περιοχή του DNA και θα προσθέσει νουκλεοτίδια συμπληρωματικά στον κλώνο DNA του εκμαγείου. Αυτό συμβαίνει μέχρι να συναντήσει το δεύτερο εκκινητή.

Μετά από μια επιτυχημένη αντίδραση τερματισμού, θα υπάρχουν δύο έλικες DNA αντί για τη μία έλικα DNA που χρησιμοποιήθηκε στο αρχικό στάδιο. Σε καθεμία από τις δύο έλικες DNA, ένας κλώνος θα είναι ο αρχικός κλώνος που παρέχεται από το δείγμα DNA. Ο άλλος κλώνος θα είναι ο συμπληρωματικός κλώνος που συντίθεται από την πολυμεράση DNA κατά τη διάρκεια της PCR.

Τα τρία στάδια της αντίδρασης PCR είναι η μετουσίωση, η ανόπτηση και η επέκταση ή ο τερματισμός. (Φωτογραφία:Flickr)

Ποια είναι η αρχή πίσω από την ενίσχυση DNA με χρήση PCR;

Τα στάδια μετουσίωσης, ανόπτησης και πολυμερισμού περιλαμβάνουν έναν κύκλο PCR. Μια τυπική αντίδραση PCR μπορεί να απαιτεί 25-35 κύκλους για βέλτιστη ενίσχυση του DNA.

Στο τέλος ενός κύκλου, το μοναδικό πρότυπο DNA θα σχηματίσει δύο μόρια DNA. Στο τέλος δύο κύκλων, τα δύο DNA θα σχηματίσουν τέσσερα μόρια DNA που στη συνέχεια θα ενισχυθούν σε οκτώ μόρια DNA στο τέλος τριών κύκλων. Στο τέλος n κύκλων, θα υπάρχουν 2n αντίγραφα του αρχικού προτύπου DNA.

Μετά από κάθε κύκλο, ο αριθμός των μορίων DNA που μπορούν να λειτουργήσουν ως πρότυπα για τον επόμενο κύκλο αυξάνεται εκθετικά. Αυτή η αύξηση στον κύκλο του αριθμού του προτύπου μετά τον κύκλο είναι η βάση πίσω από την ενίσχυση των μορίων DNA στην PCR.

Εκθετική ενίσχυση των μορίων DNA με χρήση της τεχνικής PCR (Photo Credit :Enzoklop/Wikimedia commons)

Ποια είναι τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της PCR;

Τα βασικά πλεονεκτήματα της τεχνικής PCR είναι ότι είναι ικανή να παράγει εκατομμύρια έως δισεκατομμύρια αντίγραφα DNA μέσα σε λίγες μόνο ώρες. Η τεχνική είναι γρήγορη, σχετικά εύκολη στην εκμάθηση και μπορεί να εκτελεστεί υπό βασικές εργαστηριακές συνθήκες.

Το κύριο μειονέκτημα είναι ότι η τεχνική είναι εξαιρετικά ευαίσθητη, επομένως το δείγμα που χρησιμοποιείται για ενίσχυση πρέπει να είναι απαλλαγμένο από ρύπους. Ακόμη και μικρά ίχνη ανεπιθύμητου DNA μπορεί να ενισχυθούν μαζί με το DNA που μας ενδιαφέρει, δίνοντας ψευδή αποτελέσματα.

Ένα άλλο μειονέκτημα είναι η απαίτηση πληροφοριών αλληλουχίας του DNA για τον σχεδιασμό εκκινητών. Επιπλέον, οι εκκινητές μπορεί περιστασιακά να ανόπτονται σε λάθος θέσεις του DNA. Μια τέτοια μη ειδική ανόπτηση των εκκινητών μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την ενίσχυση του λανθασμένου θραύσματος DNA.

Σε ένα σπάνιο σενάριο, η πολυμεράση DNA μπορεί να ενσωματώσει μια λάθος βάση, οδηγώντας σε αλλαγή στην αλληλουχία του DNA που μας ενδιαφέρει, η οποία μπορεί να επηρεάσει την κατάντη διαδικασία.

Για μια επιτυχημένη αντίδραση PCR, το μόνο που χρειάζεται να έχετε είναι καθαρό γενετικό υλικό, ένα κατάλληλο σύνολο εκκινητών και μια κατάλληλη θερμοκρασία ανόπτησης.

Πού μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτή η τεχνολογία;

Η κύρια εφαρμογή της PCR είναι η επιλεκτική απομόνωση DNA από μικτά δείγματα DNA. Αυτό μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών, γενετικών ασθενειών και αρκετών τύπων καρκίνου σε σύντομο χρονικό διάστημα. Χρησιμοποιείται επίσης στις ιατροδικαστικές επιστήμες για τον εντοπισμό εγκληματιών και τον έλεγχο της καταγωγής.

Αποτελεί τη βάση των περισσότερων εφαρμογών που αφορούν τη μοριακή βιολογία, την κλωνοποίηση γονιδίων, την τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA και τη μεταλλαξιογένεση.

Συμπέρασμα

Η πρακτική πρόοδος της απλής και ευέλικτης τεχνικής PCR, όπως ορίζεται από τον Kary Mullis, έχει αλλάξει δραστικά τη βιολογική έρευνα. Το μόνο που έχουμε να κάνουμε είναι να αναμίξουμε όλα τα συστατικά της PCR στις κατάλληλες συγκεντρώσεις σε ένα μικρό σωληνάριο, να το φορτώσουμε στη μηχανή PCR (θερμοκυκλωτή) και να περιμένουμε μερικές ώρες. Μετά την περίοδο αναμονής, οι ερευνητές θα έχουν εκατομμύρια έως ένα δισεκατομμύριο αντίγραφα του DNA που σας ενδιαφέρουν. Δεν είναι καταπληκτικό;

Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η PCR θα είναι πάντα μια γρήγορη και αξιόπιστη τεχνική για τη δημιουργία αντιγράφων DNA, σε σύγκριση με τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν πριν από αυτήν την ανακάλυψη που αλλάζει το παιχνίδι.