Διαφορά μεταξύ PCR και RT PCR

Κύρια διαφορά – PCR έναντι RT-PCR

Η PCR και η RT-PCR είναι δύο σημαντικές τεχνικές στη μοριακή βιολογία. Η PCR αναπτύχθηκε από τον Kary Mullis τη δεκαετία του 1980. Είναι ικανό να αυξάνει τον αριθμό των αντιγράφων ενός συγκεκριμένου γονιδίου με εκθετικό τρόπο, διευκολύνοντας την ανίχνευση του συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Taq Η πολυμεράση είναι το ένζυμο που χρησιμοποιείται συχνότερα στα συστήματα PCR. Είναι ένα θερμοσταθερό ένζυμο. Στην RT-PCR, η αντίστροφη μεταγραφή ακολουθείται από PCR. Το ένζυμο, η αντίστροφη μεταγραφάση εμπλέκεται στη σύνθεση του συμπληρωματικού DNA από το RNA. Η κύρια διαφορά μεταξύ PCR και RT-PCR είναι ότι η PCR χρησιμοποιεί δίκλωνο DNA ως πρότυπο ενώ η RT-PCR χρησιμοποιεί RNA ως πρότυπο.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι η PCR
      – Ορισμός, Διαδικασία, Εφαρμογή
2. Τι είναι η RT PCR
      – Ορισμός, Χαρακτηριστικά, Εφαρμογή
3. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ PCR και RT PCR
      – Σύγκριση βασικών διαφορών

Βασικοί όροι:PCR, RT-PCR, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, πρότυπο DNA, πολυμεράση DNA, μετουσίωση, ανόπτηση, επέκταση εκκινητή

Τι είναι η PCR

PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ) είναι μια σχετικά απλή αλλά επαναστατική μέθοδος. Η PCR χρησιμοποιεί την ικανότητα του ενζύμου, της DNA πολυμεράσης να συνθέτει νέους κλώνους DNA με συμπληρωματικό τρόπο στον προσφερόμενο κλώνο μήτρας. Η PCR είναι μια απαραίτητη τεχνική που χρησιμοποιείται τόσο σε κλινικά όσο και σε ερευνητικά εργαστήρια για λειτουργική ανάλυση γονιδίων, διάγνωση και παρακολούθηση κληρονομικών ασθενειών, κλωνοποίηση DNA, αλληλούχιση και ενίσχυση αρχαίου DNA. Το εκμαγείο DNA, τα νουκλεοτίδια, οι εκκινητές και η DNA πολυμεράση είναι τα τέσσερα κύρια συστατικά της PCR. Το πρότυπο DNA είναι συνήθως ένα δίκλωνο DNA με την αλληλουχία στόχο, η οποία πρόκειται να ενισχυθεί. Taq DNA πολυμεράση που απομονώνεται από το Thermus aquatics χρησιμοποιείται συνήθως στην PCR. Το Pfu DNA πολυμεράση είναι ένας άλλος τύπος πολυμεράσης DNA με υψηλή πιστότητα. Και τα δύο Taq και Pfu Οι πολυμεράσες είναι ανθεκτικές στη θερμότητα. Τα νουκλεοτίδια που προστίθενται από τις πολυμεράσες DNA είναι η αδενίνη (Α), η γουανίνη (G), η κυτοσίνη (C) και η θυμίνη (Τ). Δεδομένου ότι η DNA πολυμεράση μπορεί να προσθέσει μόνο ένα νέο νουκλεοτίδιο σε ένα άκρο 3' ενός προϋπάρχοντος κλώνου DNA, απαιτείται ένας ολιγονουκλεοτιδικός εκκινητής για την έναρξη της σύνθεσης DNA. Η απαίτηση ενός εκκινητή στην PCR επιτρέπει την οριοθέτηση μόνο μιας συγκεκριμένης περιοχής στο πρότυπο. Η αλληλουχία στόχος πλαισιώνεται από εμπρόσθιους και ανάστροφους εκκινητές. Στο τέλος μιας PCR, νέα αντίγραφα που ονομάζονται αμπλικόνια μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA συσσωρεύονται σε δισεκατομμύρια. Τα στοιχεία της PCR θα πρέπει να βελτιστοποιούνται με τέτοιο τρόπο ώστε να βελτιώνεται η απόδοση της PCR, ελαχιστοποιώντας παράλληλα την αποτυχία.

Η PCR είναι μια αυτοματοποιημένη διαδικασία που γίνεται από θερμικούς κυκλοποιητές, οι οποίοι έχουν τη δυνατότητα εναλλαγής μεταξύ διαφορετικών θερμοκρασιών. Η PCR είναι μια διαδικασία τριών βημάτων.

1. Μετουσίωση – Το δίκλωνο πρότυπο DNA διαχωρίζεται σε δύο μονούς κλώνους με θέρμανση στους 94-95 °C.
2. Ανόπτηση – Ο μπροστινός και ο ανάστροφος εκκινητής συνδέονται με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες στο πρότυπο. Η θερμοκρασία αυτού του βήματος εξαρτάται από τη θερμοκρασία τήξης του συνδυασμού ασταριού.
3. Επέκταση Primer – Το ένζυμο πολυμεράσης DNA επεκτείνει καθέναν από τους εκκινητές στο 3' άκρο τους προσθέτοντας συμπληρωματικές βάσεις στον αναπτυσσόμενο κλώνο. Η βέλτιστη θερμοκρασία του Taq πολυμεράση, 72 °C χρησιμοποιείται ως θερμοκρασία στο βήμα επέκτασης. Ο χρόνος της επέκτασης εξαρτάται από τον αριθμό των ζευγών βάσεων στο σκέλος του προτύπου.

Τα τρία βήματα επαναλαμβάνονται 28-35 φορές.

Εικόνα 1:Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Τα προϊόντα της PCR κλασματοποιούνται σε μέγεθος με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης σε σύγκριση με μια σκάλα DNA. Η απεικόνιση του DNA σε ένα πήκτωμα αγαρόζης γίνεται με χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και παρατήρηση υπό υπεριώδη ακτινοβολία. Οι ενισχυμένες ζώνες DNA κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία σε ένα πήκτωμα χρωματισμένο με βρωμιούχο αιθίδιο φαίνονται στο σχήμα 2. Η σκάλα DNA εμφανίζεται στο πιο αριστερό φρεάτιο.

Εικόνα 2:Ζώνες DNA

Τι είναι η RT-PCR

RT-PCR (Αλυσωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης ) είναι μία από τις πιο ευαίσθητες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του mRNA. Το RNA είναι το κατάλληλο πρότυπο για τη συλλογή πληροφοριών είτε για τη γονιδιακή έκφραση ενός φυσιολογικού ιστού είτε για τη γονιδιακή έκφραση ενός μολυσμένου ιστού. Το πρότυπο για την RT-PCR μπορεί να είναι είτε ολικό RNA είτε ιικό ή βακτηριακό RNA αντίστοιχα. Το RNA μεταγράφεται αντίστροφα σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) από το ένζυμο, την αντίστροφη μεταγραφάση. Η βέλτιστη θερμοκρασία της ανάστροφης μεταγραφάσης είναι 46 °C. Το cDNA χρησιμοποιείται σε PCR προκειμένου να ληφθεί το προϊόν. Τα βήματα στην PCR αντίστροφης μεταγραφής φαίνονται στην εικόνα 3 .

Εικόνα 3:RT-PCR

Η RT-PCR μπορεί να εκτελεστεί σε αντιδράσεις δύο ή ενός σταδίου. Στην αντίδραση δύο σταδίων, η αντίστροφη μεταγραφή και η PCR εκτελούνται σε δύο ξεχωριστά στάδια. Σε RT-PCR ενός σταδίου, η αντίστροφη μεταγραφή ακολουθείται από PCR σε ένα μόνο σωληνάριο με διαδοχικό τρόπο. Τόσο το cDNA όσο και το τελικό προϊόν PCR μπορούν να τρέξουν σε πήκτωμα αγαρόζης για σκοπούς κλασματοποίησης μεγέθους και οπτικοποίησης. Η RT-PCR ενός βήματος και δύο βημάτων φαίνονται στο σχήμα 4.

Εικόνα 4:RT-PCR ενός βήματος και δύο βημάτων

Difference Between PCR and RT-PCR

Ορισμός

PCR: Η PCR είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στη μοριακή βιολογία για την ενίσχυση ενός τμήματος DNA που δημιουργεί εκατομμύρια αντίγραφα μιας αλληλουχίας DNA.

RT-PCR: Η RT-PCR είναι μια παραλλαγή της PCR που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης στη μοριακή βιολογία.

Βήματα

PCR: Η μετουσίωση, η ανόπτηση και η επέκταση είναι τα τρία βήματα στην PCR.

RT-PCR: Στην RT-PCR, η αντίστροφη μεταγραφή ακολουθείται από PCR.

Πρότυπο

PCR: Ένα δίκλωνο μόριο DNA χρησιμεύει ως πρότυπο για την PCR.

RT-PCR: Ένα μονόκλωνο μόριο RNA χρησιμεύει ως πρότυπο για την αντίστροφη μεταγραφή. Ένα μονόκλωνο μόριο DNA χρησιμεύει ως πρότυπο για την PCR.

Ένζυμα που χρησιμοποιούνται

PCR: Η πολυμεράση DNA χρησιμοποιείται ως ένζυμο στην PCR.

RT-PCR: Η αντίστροφη μεταγραφάση και η DNA πολυμεράση χρησιμοποιούνται ως ένζυμα στην RT-PCR.

Primers

PCR: Στην PCR χρησιμοποιούνται εκκινητές προς τα εμπρός και ανάστροφα.

RT-PCR: Μόνο ο αντίστροφος εκκινητής χρησιμοποιείται για την αντίστροφη μεταγραφή και τόσο οι εμπρός όσο και οι ανάστροφοι εκκινητές χρησιμοποιούνται στην PCR.

Ευαισθησία

PCR: Η PCR είναι μια ευαίσθητη μέθοδος.

RT-PCR: Η RT-PCR είναι πιο ευαίσθητη από την PCR.

Εφαρμογές

PCR: Η PCR χρησιμοποιείται στη λειτουργική ανάλυση γονιδίων, τη διάγνωση και την παρακολούθηση κληρονομικών ασθενειών, την κλωνοποίηση DNA, την αλληλουχία DNA και την ενίσχυση αρχαίου DNA.

RT-PCR: Η RT-PCR χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης.

Συμπέρασμα

Η PCR και η RT-PCR είναι δύο από τις σημαντικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται στη μοριακή βιολογία. Τόσο η PCR όσο και η RT-PCR είναι αυτοματοποιημένες τεχνικές ικανές να αυξάνουν εκθετικά τον αριθμό των αντιγράφων μιας αλληλουχίας DNA στόχου, η οποία ορίζεται από τον εμπρόσθιο και τον ανάστροφο εκκινητή. Στην PCR, το δίκλωνο DNA χρησιμοποιείται ως πρότυπο. Με PCR, μπορεί να γίνει κλωνοποίηση DNA, προσδιορισμός αλληλουχίας DNA και λειτουργική ανάλυση των γονιδίων. Στην RT-PCR, η γονιδιακή έκφραση σε έναν συγκεκριμένο ιστό μπορεί να παρατηρηθεί με ενίσχυση του RNA. Η κύρια διαφορά μεταξύ PCR και RT-PCR είναι στα εκμαγεία τους που χρησιμοποιούνται σε κάθε αντίδραση και στις εφαρμογές τους.

Αναφορά:

1.Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)." Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας. Εθνική Βιβλιοθήκη Ιατρικής των ΗΠΑ, n.d. Ιστός. Διαθέσιμο εδώ. 01 Ιουνίου 2017.
2 "Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (ή PCR)." Κλωνοποίηση και Μοριακή Ανάλυση Γονιδίων. Ν.π., ν.δ. Ιστός. Διαθέσιμο εδώ. 01 Ιουνίου 2017. 
3. Biolabs, Νέα Αγγλία. "CDNA Synthesis &RT-PCR." CDNA Synthesis &RT-PCR | ΡΑΜΦΟΣ. Ν.π., ν.δ. Ιστός. Διαθέσιμο εδώ. 01 Ιουνίου 2017.

Ευγενική προσφορά εικόνας:

1 "Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης" Από τον Enzoklop – Δική του εργασία (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Από Rainis Venta – Δικό έργο (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia
3. «Αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης» Από Jpark623 – Δική εργασία (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia
4. "One-step vs two-step RT-PCR" By Jpark623 – Ίδιο έργο (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia