Πώς λειτουργεί η αλληλουχία DNA

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας είναι η διαδικασία που εμπλέκεται στον προσδιορισμό μιας νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Κατά τη διάρκεια του προσδιορισμού της αλληλουχίας, το θραύσμα DNA είναι τερματικά σημασμένο με σημασμένα με φθορισμό νουκλεοτίδια με PCR. Αυτή η διαδικασία χρησιμοποιεί τέσσερις τύπους σημασμένων με φθορισμό νουκλεοτιδίων, και είναι διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs). Τα ddNTP στερούνται μιας ομάδας 3' ΟΗ στην οποία είναι συνδεδεμένη η φωσφορική ομάδα του εισερχόμενου νουκλεοτιδίου. Επομένως, όταν προστίθεται ένα ddNTP στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα, δεν θα υπάρχει περαιτέρω προσθήκη νουκλεοτιδίων στο 3' άκρο της αλυσίδας. Αυτό σημαίνει ότι η προσθήκη ενός ddNTP στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα τερματίζει την ανάπτυξη της αλυσίδας. Εφόσον τα ddNTPs προστίθενται στο μίγμα PCR σε χαμηλές συγκεντρώσεις, κάθε αναπτυσσόμενη αλυσίδα τερματίζεται σε διαφορετικά επίπεδα. Ο εκπεμπόμενος φθορισμός ανιχνεύεται για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του θραύσματος DNA στο τέλος της PCR.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι η αλληλουχία DNAς
     – Ορισμός, Τύποι
2. Πώς λειτουργεί η αλληλούχιση DNA
     – Διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας DNA

Βασικοί όροι:διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs), δείκτης φθορισμού, ηλεκτροφόρηση γέλης, αλληλουχία επόμενης γενιάς, αλληλουχία νουκλεοτιδίων, PCR, αλληλουχία Sanger

Τι είναι η αλληλουχία DNA 

Η αλληλουχία DNA είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός συγκεκριμένου μορίου DNA. Χρησιμοποιεί επισημασμένα με φθορισμό νουκλεοτίδια, τα οποία ενσωματώνονται κατά τη διάρκεια της PCR. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας που βασίζονται στις τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του φθορισμού:η αλληλουχία Sanger και η αλληλουχία επόμενης γενιάς.

Sanger Sequencing

Η αλληλουχία Sanger, που αναπτύχθηκε από τον Fredric Sanger το 1975, είναι η πρώτη μέθοδος αλληλουχίας που αναπτύχθηκε. Είναι επίσης γνωστή ως μέθοδος τερματισμού αλυσίδας από εμπλέκεται στην επιλεκτική ενσωμάτωση ddNTP που τερματίζουν την αλυσίδα κατά τη διάρκεια in vitro σύνθεση DNA. Στην αλληλουχία Sanger, τα αμπλικόνια διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση γέλης. Η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των θραυσμάτων DNA που χρησιμοποιούνται στην κλωνοποίηση και των θραυσμάτων που ενισχύονται με PCR. Μια καθορισμένη αλληλουχία DNA φαίνεται στο σχήμα 1.

Εικόνα 1:Αλληλουχία DNA

Αλληλουχία επόμενης γενιάς

Οι πιο πρόσφατες τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας DNA είναι συλλογικά γνωστές ως αλληλουχία επόμενης γενιάς. Είναι επίσης μια μέθοδος τερματισμού αλυσίδας. Η αλληλουχία επόμενης γενιάς χρησιμοποιεί τριχοειδή ηλεκτροφόρηση για τον διαχωρισμό αμπλικονίων με διάφορα μήκη που δημιουργούνται με τη μέθοδο τερματισμού αλυσίδας. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας επόμενης γενιάς χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό μεγάλου αριθμού νουκλεοτιδίων ανά δοκιμή, όπως στον προσδιορισμό αλληλουχίας γονιδιώματος.

Πώς λειτουργεί η αλληλουχία DNA

Κατά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA, νουκλεοτίδια σημασμένα με φθορισμό προστίθενται σε ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA με PCR. Για την επιμήκυνση του κλώνου του DNA, χρησιμοποιούνται κανονικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs). Ωστόσο, ddNTPs προστίθενται στο μίγμα της αντίδρασης, το οποίο είναι επισημασμένο με φθορισμό. Δεδομένου ότι τα ddNTP δεν έχουν ομάδα 3' ΟΗ στο μόριο σακχάρου δεοξυριβόζης, μπορεί να μην συμβεί περαιτέρω ανάπτυξη της αλυσίδας, τερματίζοντας την ανάπτυξη της αλυσίδας. Η ραχοκοκαλιά σακχάρου-φωσφορικού του DNA σχηματίζεται από το σχηματισμό φωσφοδιεστερικών δεσμών μεταξύ της ομάδας 3' ΟΗ του σακχάρου δεοξυριβόζης και της φωσφορικής ομάδας του εισερχόμενου νουκλεοτιδίου. Ωστόσο, τα ddNTP προστίθενται σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Επομένως, δεν τερματίζουν την ανάπτυξη της αλυσίδας αμέσως.

Τέσσερις τύποι ddNTP προστίθενται σε τέσσερα ξεχωριστά μείγματα PCR. Εκτελούνται τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις PCR προσθέτοντας ddATP, ddGTP, ddCTP και ddTTP. Επομένως, σε κάθε μίγμα αντίδρασης, η ανάπτυξη της αλυσίδας τερματίζεται στα νουκλεοτίδια Α, G, C και Τ, αντίστοιχα. Για παράδειγμα, στο μίγμα αντίδρασης με προστιθέμενο ddATP, η ανάπτυξη διαφορετικών αμπλικονίων τερματίζεται σε κάθε νουκλεοτίδιο Α στο θραύσμα DNA. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA με την αλληλουχία Sanger φαίνεται στο σχήμα 2 .

Εικόνα 2:Αλληλουχία Sanger

Καθένας από τους τέσσερις τύπους νουκλεοτιδίων επισημαίνεται με ξεχωριστό χρώμα φθορισμού. το ddATP επισημαίνεται με πράσινη βαφή. το ddGTP επισημαίνεται με κίτρινη βαφή. το ddCTP επισημαίνεται με μπλε, το ddTTP επισημαίνεται με κόκκινη βαφή . Ως εκ τούτου, τα αμπλικόνια των τεσσάρων αντιδράσεων PCR επισημαίνονται σε ξεχωριστά χρώματα.

Μετά την ενίσχυση του ενδιαφερόμενου θραύσματος DNA, τα αμπλικόνια διαχωρίζονται είτε με ηλεκτροφόρηση γέλης είτε με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του θραύσματος DNA μπορεί να προσδιοριστεί με την ανίχνευση του εκπεμπόμενου φθορισμού. Η αλληλουχία νουκλεοτιδίων των μακρών θραυσμάτων 750-1.000 ζευγών βάσεων μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί ανά εκτέλεση με ανάλυση αλληλουχίας Sanger. Ωστόσο, ο προσδιορισμός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός ολόκληρου γονιδιώματος παραμένει αμφισβητούμενος λόγω του μεγάλου αριθμού νουκλεοτιδίων στα γονιδιώματα. Ωστόσο, οι τεχνικές αλληλουχίας επόμενης γενιάς, όπως η αλληλουχία 454, μπορούν να διαβαστούν περίπου 20 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων ανά μεμονωμένη εκτέλεση.

Συμπέρασμα

Η αλληλουχία DNA είναι μια τεχνική μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων των θραυσμάτων DNA. Κατά τη διάρκεια της αλληλουχίας, νουκλεοτίδια επισημασμένα με φθορισμό προστίθενται στα θραύσματα DNA με PCR. Ανιχνεύοντας τον εκπεμπόμενο φθορισμό, μπορεί να προσδιοριστεί η αλληλουχία νουκλεοτιδίων.

Αναφορά:

1. «Αλληλουχία DNA». Khan Academy , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. «Ακολουθία DNA» του Sjef – Ίδιο έργο, Δημόσιος Τομέας) μέσω του Commons Wikimedia
2. «Διδεσοξυ-Μέθοδος» Του Christoph Goemans (τροποποιητής) – Δρ. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) μέσω του Commons Wikimedia